[发明专利]小菜蛾对Bt杀虫蛋白抗性的实时荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测小菜蛾（Plutella xylostella(L.)）对苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的抗性的PCR检测试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒包含以下引物序列：

正向引物：5′-GCACACACCATGACCGTAGCAG-3′，

反向引物：5′-GGCTCTTCGTGACATCG-3′。

2.一种检测小菜蛾（Plutella xylostella(L.)）对苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的抗性的PCR检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待测小菜蛾的RNA样品，并反转录为cDNA模板；

（2）将所述cDNA模板加入到含有特异性引物对的PCR反应液中得到PCR反应体系；

（3）进行实时荧光定量PCR检测；

其特征在于：所述特异性引物对是以小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡上膜结合形式的碱性磷酸酶基因的保守片段区为靶目标序列设计得到的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡上膜结合形式的碱性磷酸酶基因的保守片段区的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述特异性引物对的序列如下：

正向引物：5′-GCACACACCATGACCGTAGCAG-3′，

反向引物：5′-GGCTCTTCGTGACATCG-3′。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为：94℃预变性6min，94℃变性30sec，61℃退火30sec，72℃延伸35sec，40个循环。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：若所述待测小菜蛾的样品产生典型的“S”型扩增曲线及单峰融解曲线，且Ct值≥25，则说明所述小菜蛾待测的样品对苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白产生抗性；若Ct值≤22，则说明待测小菜蛾的样品未对苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白产生抗性。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述待测小菜蛾的RNA样品为小菜蛾4龄幼虫中肠的RNA样品。