[发明专利]建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法及其产品

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法，以及使用该方法，对幽门螺杆菌进行快速鉴定的方法。

背景技术

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称Hp）首先由巴里·马歇尔(Barry J. Marshall)和罗宾·沃伦(J. Robin Warren)二人发现。幽门螺杆菌属弯曲菌科螺杆菌属，是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌。长2.5～4.0μm，宽0.5～1.0μm，革兰染色阴性，有动力，在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。在绵羊血琼脂培养基上生长时，除典型的湿润、无色透明、扁平状、边缘整齐。幽门螺杆菌是微需氧菌，环境氧要求5～8%，在大气或绝对厌氧环境下不能生长。该菌对于青霉素、阿莫西林敏感，对万古霉素（vancomycin）、三甲氧苄胺嘧啶乳酸盐（trimethoprim lactate）、两性霉素B（amphotercin B）、多粘菌素B （polymyxin B）等抗生素具有一定的抗性。

幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT) 淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构 (WHO/IARC) 将幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌原。幽门螺杆菌的传染力很强，可通过手、不洁食物、不洁餐具、粪便等途径传染。行病学研究表明幽门螺杆菌感染了世界范围内一半以上的人口，其发病率各个国家不同，甚至同一国家的各个地区也不相同。目前已知发病率的高低与社会经济水平，人口密集程度，公共卫生条件以及水源供应有较密切的关系。也有报道指出，幽门螺杆菌的感染有明显的季节分布特征，以7～8月份为高峰。在亚洲地区，中国内地、中国香港、越南、印度等少年幽门螺杆菌的感染率分别60%、50%、40%、70%。慢性胃炎患者的胃粘膜活检标本中幽门螺杆菌检出率可达80%～90%，而消化性溃疡患者更高，可达95%以上，甚至接近100%。胃癌由于局部上皮细胞已发生异化，因此检出率高低报道不一。在自然人群中初出生的新生儿血清中抗幽门螺杆菌-IgG水平很高，接近成人水平，可能从母体获得被动免疫抗体之故。半年后迅速下降。在我国及大多数发展中国家中阳性率待降至 10%～20%后又迅速回升。大约在10岁以后即迅速上升达到或接近成人阳性检出率水平。因此加紧对该菌的检测研究具有十分重要的意义。

为了建立适合本病诊断和流行病学调查的快速、敏感、特异、准确的方法，国内外许多学者进行了大量研究，并取得了显著的成绩，已经有许多不同的技术用于幽门螺杆菌的测定。依据取材有无创伤性，目前测定幽门螺杆菌的方法可分为两大类：①无创检查：包括血清学方法、同位素标记尿素的呼气试验和胃液聚合酶链反应等。②创伤性检查：均为胃镜依赖方法，包括多种形态学、微生物学和分子生物学技术等。例如快速脲酶试验(hpRut)、血清学E1SA法、胃黏膜病理活检法、细菌培养、尿素[13C]片呼气试验等方法。快速脲酶试验的灵敏度、特异性、诊断效率、阴性预示值都相对较差，易因个人经验差异、试剂质量、活检标本中可能混人血液等因素影响；组织切片染色法易受菌体分布不均匀及其他革兰阴性杆菌存在的影响；幽门螺杆菌在微需氧环境下生长，培养条件要求高，不易存活，对细菌培养做临床诊断造成很大困难，不易推广；而呼气试验对患者和医务人员以及周围环境的污染尚未解决；血清学E1SA法虽灵敏度较好，但痛苦大、所需仪器昂贵、操作步骤繁琐费时、需要专业人员。

近年来，已经出现质谱技术来检测核酸和蛋白质领域，其中质谱技术应用于核酸检测领域的理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP的分子量依次为271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da（其中ddTMP是经过修饰的），它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点（SNP）、插入/缺失（InDel）、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化（copy number variation，CNV）等多种DNA变化类型进行检测。