[发明专利]一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用

说明书

技术领域

本发明涉及到兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用。 

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，该病以免疫抑制和断奶仔猪多系统衰竭为特征，病猪主要表现生长发育不良、贫血、呼吸困难、腹泻、衰弱、增重迟缓、淋巴结肿大等临床症状。自1991年在加拿大猪群中爆发PMWS以来，PMWS已给全世界养猪业造成极大的经济损失。PCV2不但可以引发断奶仔猪多系统的衰竭，还能够使感染猪的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，引起继发感染，加重病情。此外，PCV2还与母猪繁殖障碍、增生性坏死性肺炎、猪皮炎肾病综合征和猪呼吸道疾病综合征等病症相关。近年来，我国猪群也有PMWS流行，所造成的危害十分严重。 

疫苗免疫是控制PCV2感染及其相关疾病的重要手段。目前，国内生产的疫苗为全病毒灭活疫苗，如文献CN101240264A公开了一种全病毒灭活疫苗，但PCV2在体外细胞内增殖能力弱，培养难度较大，病毒最终滴度低，提供的病毒抗原含量有限，制备高质量PCV2疫苗需要浓缩病毒抗原，这将直接导致疫苗生产成本高昂，不能满足动物疫苗质优价廉的实际要求。文献CN101180406A、CN101884787A和CN101358182A均公开了用重组杆状病毒表达PCV2 ORF2基因编码的Cap蛋白，并将其用于制备PCV2疫苗，其中，所描述的重组杆状病毒都只含有一个启动子，且未优化其生产工艺条件，致使生产获得的病毒蛋白产率及质量均较低，且所表达的目的基因有其它多余序列（如6×His标签、分泌性信号肽等）的修饰，不利于表达的外源蛋白形成病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs），这些重组杆状病毒构建技术策略存在表达的目的蛋白免疫原性部分丧失的缺陷。此外，由于该亚单位疫苗的佐剂和免疫刺激物等因素影响，其实践中的免疫效果并不佳。因此，急需研制一种产率更高、免疫原性及免疫效果更佳的PCV2亚单位疫苗及其制备方法和其所制备的疫苗组合物。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组杆状病毒转移载体，所述载体是分别在pFastBac Dual转移载体的P10启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2。 

在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2是完整的、未经修饰的PCV2b ORF2。 

在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

在本发明的一个优选技术方案中，所述PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2分别通过BamHI/Hind III和Kpn I/Xho I双酶切插入pFastBac Dual转移载体中。 

在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒转移载体为pFastBac Dual-2ORF2。 

本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法，包括如下步骤： 

（1）获得本发明所述的重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2ORF2； 

（2）同源重组，产生重组杆状病毒DNA； 

（3）包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒。 

在本发明的一个优选技术方案中，所述的同源重组是将步骤(1)所述的重组杆状病毒转移载体转化进含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，产生重组杆状病毒DNA。 

在本发明的一个优选技术方案中，所述的包装是将步骤(2)产生的重组杆状病毒DNA感染sf9细胞，包装出重组杆状病毒。 

本发明的另一目的在于提供一种重组杆状病毒，由本发明所述的猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法制得。 

在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒为rBac-2ORF2。 

本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤： 

（1）获得本发明制备的重组杆状病毒； 

（2）培养宿主细胞，接种步骤（1）的重组杆状病毒； 

（3）灭活病毒； 

（4）分离纯化重组PCV2 Cap蛋白； 

（5）用纯化的重组PCV2 Cap蛋白制备亚单位疫苗。