[发明专利]一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用

权利要求书

1.一种重组杆状病毒转移载体，所述载体是分别在pFastBac Dua1转移载体的P10启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2，优选所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2是完整的、未经修饰的PCV2b ORF2，更优选所述PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2分别通过BamH I/Hind III和Kpn I/Xho I双酶切插入pFastBac Dual转移载体中。

2.如权利要求1所述的重组杆状病毒转移载体，其特征在于，所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.如权利要求1-2任一项所述的重组杆状病毒转移载体，其特征在于，所述重组杆状病毒转移载体为pFastBac Dua1-2ORF2。

4.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法，包括如下步骤：

（1）获得如权利要求1-5任一项所述的重组杆状病毒转移载体；

（2）同源重组，产生重组杆状病毒DNA；

（3）包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的同源重组是将步骤(1)所述的重组杆状病毒转移载体转化进含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，产生重组杆状病毒DNA。

6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的包装是将步骤(2)产生的重组杆状病毒DNA转染sf9细胞，包装出重组杆状病毒。

7.一种重组杆状病毒，由权利要求4-6任一项所述的方法制备得到，优选所述重组杆状病毒为rBac-2ORF2。

8.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

（1）获得权利要求9所述的重组杆状病毒；

（2）培养宿主细胞，接种步骤（1）的重组杆状病毒；

（3）灭活病毒；

（4）分离纯化重组PCV2 Cap蛋白；

（5）用纯化的重组PCV2 Cap蛋白制备亚单位疫苗。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）包括利用生物反应器无血清培养基悬浮培养sf9细胞作为宿主细胞，按感染复数（MOI）为0.001-10的量接种步骤（1）所述的重组杆状病毒后，继续培养，使PCV2 Cap蛋白在sf9细胞中高效表达。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，生物反应器的培养参数设定为：pH6.0-6.5、温度25-30℃、溶氧30-80%、搅拌速度50-250rpm，优选生物反应器的培养参数设定为pH6.2，温度27℃，溶氧50%，搅拌速度100-180rpm。

11.如权利要求8-10任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）包括将细胞经过5L-50L培养体积逐级放大培养后，于50L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒；或者，将细胞经过5L-50L-500L培养体积逐级放大的培养后，于500L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒。

12.如权利要求8-11任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）采用批式培养方法、分批补料培养方法、半连续灌注培养方法或连续灌注培养方法的任一种或其组合进行培养，优选为分批补料培养方法进行培养。

13.如权利要求8-12任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）包括向细胞培养液中加入BEI灭活剂灭活所述的重组杆状病毒，并在灭活结束后使用硫代硫酸钠中和过量的BEI。

14.如权利要求8-13任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）包括收集步骤（3）灭活后的细胞培养物，通过离心或中空纤维过滤除去细胞碎片，得到含有PCV2Cap蛋白的细胞培养上清。

15.如权利要求8-14任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）包括对步骤（4）纯化的重组PCV2 Cap蛋白进行定量，加入佐剂，制备疫苗。