[发明专利]一种去除疫苗中宿主DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种疫苗中宿主DNA的去除方法。

背景技术

狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人畜共患疾病，在全球分布广泛，每年死于狂犬病的人数超过5.5万人，其中约95%发生在亚洲和非洲。大多数死亡事件均是被狂犬病毒感染的狗咬伤所致，受害者中30%~60%为15岁以下儿童。狂犬病的预防和治疗通常采用狂犬病疫苗。

在狂犬疫苗生产中，经病毒感染的细胞培养上清液中含有目标物狂犬病毒，而且还有宿主细胞碎片和蛋白以及宿主DNA。另外，还有细胞培养基组份。这些杂质都是需要去除的。其中，以传代细胞制备狂犬疫苗安全性的关键是细胞残余DNA的含量。中国药典规定狂犬疫苗（Vero细胞）的宿主DNA残留量不得高于100pg/剂。

传统的狂犬病毒纯化路线主要采用超滤浓缩和凝胶过滤色谱法。其中，凝胶过滤色谱法是目前最有效的纯化方法，但是该方法的纯化效果并不能满足狂犬疫苗制品新的国家标准100pg/剂的要求，主要原因是凝胶过滤色谱法是根据生物分子量大小进行分离的，而病毒与宿主DNA的分子量不相上下，不能在凝胶介质中被有效分离。

此外，采用在病毒收获液中添加硫酸鱼精蛋白的方法去除DNA，原理是硫酸鱼精蛋白可以与DNA结合，结合物容易沉淀，使用离心的方法能有效去除DNA。但是同时鱼精蛋白也与病毒结合，病毒损失严重，通常回收率只有25-30%。

此外，在超滤浓缩后加入核酸酶处理步骤，经过酶切以后的DNA变成了小片段，然后再经过凝胶过滤色谱步骤，使大部分DNA和病毒分离开。但是由于核酸酶的作用受环境条件限制，不能完全发挥效果，仍有极小一部分DNA不能和病毒分开，最终DNA残留量还停留在纳克（ng）级水平。结果只是接近国家标准，仍然很难达到合格水平。

近几年，在狂犬病毒的纯化过程中引入了离子交换色谱步骤，首先是阴离子交换色谱，让DNA和病毒一起被吸附在介质上，然后控制条件仅对病毒洗脱，能够使病毒液中DNA的残留量降低至500pg/ml，但是病毒量的回收率只有大约20%。

CN102282253A公开了一种狂犬病病毒纯化方法，使用一步阳离子交换色谱法能够使DNA的去除率达到95%以上，而病毒回收率在70%以上。所述的阳离子交换介质是MERCK公司的产品Fractogel EMD SO^3-，结合后续的核酸酶处理步骤和超速离心纯化步骤，最终得到的病毒液配制成的狂犬疫苗，在含有2.5IU有效剂量里DNA残留量小于20pg。整个纯化过程病毒回收率在50%左右。然而，CN102282253A公开的狂犬病病毒纯化工艺过于复杂，生产成本高。

CN102282253A公开了采用离子交换色谱纯化狂犬病病毒的工艺，先将被病毒感染的细胞的培养物的上清液与阳离子交换色谱担体接触，以便让狂犬病毒结合在担体上，随后从担体上洗脱该病毒。这样的工艺流程主要是为了去除病毒液中的宿主DNA残留，但是由于病毒先吸附再洗脱的做法使得病毒量损失较大。而且病毒和宿主DNA都吸附在担体上，先后洗脱病毒和DNA的做法也导致了DNA去除不彻底的后果。

因此开发一种既能有效去除DNA残留从而达到国家药典标准又能提高病毒回收率的纯化工艺非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种去除疫苗中宿主DNA的方法，包括：

步骤1）调整病毒感染的宿主细胞上清浓缩液的pH值和盐浓度，使pH值在6~8之间，盐浓度在0.2~0.5mol/L之间；

步骤2）使调整后的宿主细胞上清浓缩液与阴离子交换介质充分接触。

细胞培养上清浓缩液在与介质接触之前要进行澄清和浓缩，调整后的上清浓缩液pH值在6~8之间，盐浓度在0.2~0.5mol/L之间。上清浓缩液pH值优选在7~8之间，进一步优选在7~7.8之间；盐浓度优选0.3~0.5mol/L。

pH值的区间是狂犬病毒的活性耐受区间，越过这个区间病毒生物活性会受到很大影响。盐浓度区间则是病毒回收和DNA去除的优选区间，当盐浓度低于0.2M/L时，病毒的回收率只有8%；而当盐浓度高于0.5M/L时，DNA的去除率下降到70%。

阴离子交换色谱介质选自偶联二乙胺基乙基（DEAE）、季铵盐（Q）为配基的琼脂糖微球或者是其他具有阴离子效果的介质。本发明采用的阴离子交换层析并不需要依赖特定的填料，任何具有阴离子效果的介质都可以运用到本发明的工艺中。