[发明专利]乙型肝炎病毒HBx基因的人工转录因子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种锌指蛋白及其在转录调控目标基因方面的应用，属于分子生物学领域。

背景技术

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界最常见的癌症之一，而慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC最重要的危险因子之一，研究表明，HBV携带者的HCC发生率比非携带者高5-15倍。大约85-90％的HBV阳性HCC病例在肝细胞中都发现有HBV的整合片段，而X基因是HCC病人中整合最频繁的HBV片段。X基因(以下简称HBx)是HBV的一个ORF，其蛋白产物称为HbxAg，通常由154个氨基酸组成。目前发现HBx在HBV感染宿主以后会与细胞中的一些因子发生作用，并可能在HBV诱发宿主产生HCC(原发性肝细胞癌)的过程中起到某种调控作用。1991年美日学者将1.5kb的含HBx基因的片段注入小鼠受精卵内，得到的小鼠最后都发展为HCC，表达HbxAg和AFP，而在小鼠生前ALT一直正常。说明肝细胞单纯表达HBx，无需产生细胞损伤即可造成形态和生化改变，最终也会导致HCC。根据基于一项CD1品系的HBx转基因小鼠的研究，80-91％的雄性HBx转基因小鼠发生HCC，并于11-15个月龄时死于HCC；60-67％雌性HBx转基因小鼠发生HCC，并于12-21个月龄时死于HCC；而野生型CD1小鼠未见原发肝部肿瘤。HBx基因对于HBV自身基因组的复制是必需的，并作为转录因子调节多种细胞内蛋白功能，涉及细胞增殖、细胞周期、蛋白质降解和DNA修复等多方面，并在肿瘤晚期还参与细胞转移与血管生成相关的宿主基因的调控，因此，被认为是一种HBV来源的HCC相关的癌基因。靶向并特异地下调HBx被认为是阻断HBV感染相关的HCC的有效方法，目前研究者已经尝试了核酶、反义核酸，以及siRNA等方法人工干预下调HBx表达，但由于这些方法受核酸分子半衰期的限制，且容易产生脱靶效应，因此仍需要开发出特异的调控HBx表达的方法。

人工转录因子是通过识别DNA位点，对基因转录进行调控，因此利用少量的人工转录因子往往就能起到很好的调控效果。有研究表明合理设计的人工转录因子能够针对抑癌基因、原癌基因以及病毒的转录都起到相应的调控作用，一个合适的人工转录因子甚至可以调节某个基因家族或是整条代谢通路中的一系列相关产物，因此人工转录因子在疾病的基因治疗与抗病毒治疗等领域都具有广泛的应用前景。另外，由于人工转录因子可以进行模块化设计，通过改变DNA结合结构域可以灵活选择其作用靶位，改变其功能结构域则可以对于目的基因进行激活、抑制、甲基化等不同的调控，应用十分灵活方便。人们借鉴人工转录因子的构建思路，利用更为多样的功能结构域，构建了许多能够特异地作用于靶序列的新型蛋白，用于对DNA进行某种定点的操作。例如，将限制性内切酶的切割亚基与序列特异的锌指相连，构建人工核酸酶，从而能够任意地切割目的序列，并提高重组的效率。把DNA甲基化酶与锌指相连，构建人工甲基化酶，可以在目的启动子上引入甲基化，使得目的基因表达沉默。此外，Bushman等将HIV-1的整合酶结构域与锌指相连构建了嵌合的整合酶；Beretta等利用相似的方法构建了序列特异的拓扑异构酶。有时候人工甲基化酶等也被统称为人工转录因子，但人们更习惯将它们称为嵌合酶。

人工转录因子含有DNA结合结构域和效应功能域。结合结构域负责特异性识别和结合DNA靶序列，而效应功能域则负责调控基因转录，即上调或下调基因转录。C₂H₂锌指结构是Miller等在1985最先在非洲爪蟾的转录因子TFIIIA中发现的，是真核细胞中最常见的DNA结合结构域，在人类基因组中，大约有2％的基因编码C₂H₂锌指结构。每一个C₂H₂锌指单元由大约30个氨基酸组成，形成反平行的β折叠片与一个α螺旋(α-helix)，通过疏水作用以及其中的2个Cys残基和2个His残基与一个Zn²⁺离子的作用来稳定其结构，形状类似与人的手指，“锌指”因此而得名。