[发明专利]一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶稳定性的方法

说明书

技术领域

一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶稳定性的方法，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。

背景技术

氨肽酶是一类从蛋白质或肽链的N端酶切氨基酸残基的外肽酶的总称。它在蛋白水解产品的制备中可作为组合复配用酶，起脱苦、深度水解，制备多功能活性肽等作用，还可作为N端测序工具酶和医疗诊断用酶。

酶作为一种生物催化剂，因其半衰期短、易失活等缺点严重影响着酶的使用效果。酶的稳定性是指酶分子抵抗各种不同因素影响，维持一定空间结构，保持催化活性相对稳定的能力，包括热稳定性、pH稳定性、抗氧化性和耐有机溶剂等方面。氨肽酶作为一种工业化酶制剂，其热稳定性是一个很关键的因素。酶的热稳定性提高具有明显的优势，延长酶的储存时间、减少在运输过程中的酶活损失，使酶在较高反应温度下延长酶的反应时间，提高生产效率，有效的降低生产成本。所以，如何提高酶的稳定性，从而扩大酶的应用范围的研究越来越引起人们的重视。

目前，提高酶稳定性的策略主要从酶分子改造和微环境改良两方面入手。酶分子改造包括定点突变、化学修饰以及酶固定化等方法；微环境改良包括添加保护剂、防腐剂、蛋白酶抑制剂、抗氧化剂和还原剂等。其中化学修饰是提高和改善酶催化性能的有效方法之一。酶的化学修饰，就是利用某些专一性化学试剂处理酶蛋白，使之与酶蛋白分子中的特定氨基酸残基反应，改变这些氨基酸残基侧链的化学结构和性质，从而改变活性中心原有的空间构象，或改变酶的辅因子的成分，进而改变酶原有的特性。酶的化学修饰在改变酶的专一性、稳定性、提高药用酶的半衰期消除免疫原性，甚至改变酶的催化反应类型等方面都已取得了重大进展。

氨肽酶分子上的Lys残基末端的ε-NH₂由于具有较强的亲核性，可与小分子化学修饰剂丁二酸酐反应，从而改变酶分子的电荷以及结构，进而使酶的性质得到改善。对推动该酶今后的工业化生产和进一步的应用有积极的作用。

发明内容

本发明的目的是用丁二酸酐在经优化后的最佳修饰条件下对氨肽酶进行化学修饰，提供一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶稳定性的方法，显著提高了氨肽酶的热稳定性，修饰后酶对底物的亲和力也有所增加，同时伴随了一系列的酶学特性表征方面的变化。

本发明的技术方案：

枯草芽孢杆菌Zj016的发酵液冷冻离心、澄清、超滤浓缩、脱盐、冷冻干燥，得食品级固体氨肽酶（中国专利201010578579.1已公开，公开号CN102078012A，公开日2011-6-1），在最佳化学修饰条件下，用丁二酸酐对所得的氨肽酶进行化学修饰，得到修饰酶，主要以酶活保留率和相对酶活力为依据，得到一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶稳定性的方法，其工艺为：

A、丁二酸酐对氨肽酶的化学修饰方法

通过单因素实验考查了修饰反应pH、修饰反应时间、修饰反应温度、修饰剂与酶的质量比这四个因素对化学修饰反应的影响，以酶活保留率为指标，得出最佳的化学修饰条件：

（1）称取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液中，然后向混合液中缓慢加入10mg的丁二酸酐（SA），搅拌溶解，在整个反应过程中用2mol/L NaOH溶液维持反应体系的pH值为8.0，在4℃条件下反应1h，反应结束后，用0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液在4℃透析过夜，以除去多余的修饰剂，得到丁二酸酐修饰的氨肽酶（修饰酶液SA-AE），4℃冰箱保存；

（2）称取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液中，用0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液在4℃透析过夜，得到原酶液（AE），4℃冰箱保存。

B、修饰前后酶的部分酶学性质

（1）采用丁二酸酐对氨肽酶在优化条件下进行化学修饰，SA对AE的平均氨基修饰率为55.86%，酶活保留率为105.81%。

（2）动力学参数Km的测定

以L-亮氨酸-4-硝基苯胺为底物，在原酶和修饰酶的最佳酶活测定的条件下，测定底物浓度为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L时原酶和修饰酶的酶活。按照Lineweaver-Burk作图法取双倒数作1/v-1/s曲线，计算原酶和修饰酶的米氏常数Km和最大反应速率Vm。