[发明专利]一株盐单胞菌多基因敲除株的构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及盐单胞菌多基因敲除株的构建和应用。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，简称PHA）是一种环境友好型塑料，具有良好的生物相容性、生物可降解性、压电性等优良特性，近年来已经成为生物材料领域最为活跃的研究热点，成为能够替代石油化工塑料，解决能源危机和环境污染的新型材料。

PHA是许多微生物在碳、氮营养失衡的情况下合成的一种能作为碳源和能源的贮存颗粒，能够通过微生物发酵获得。虽然近十年来PHA产业链发展迅猛，但PHA制造过程的复杂性使其制造成本高昂，无法与以石油为基础的传统材料竞争。主要原因包括原材料成本、能耗、下游处理成本等。所以目前试图采取很多方法来降低PHA的生产成本，比如，通过基因工程改造或代谢途径改造来获得性状优良的高产菌株，探索简单有效的下游提取纯化方法，利用价格低廉的原材料等。

盐单胞菌Halomonas sp.TD01从新疆艾丁湖中分离出的一株适应范围很广的中度嗜盐菌，能在1%-20%(w/v)氯化钠条件下生长，最高生长温度为45℃，最高生长pH为11。Halomonas sp.TD01能进行无灭菌连续发酵生产PHA，能在以葡萄糖作为单一碳源时合成聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，简称PHB），发酵60h能达到80g/L的菌体干重和占菌体干重80%的PHB含量，而以丙酸或戊酸作为辅助碳源时合成聚羟基丁酸戊酸共聚酯（poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，简称PHBV），但由于丙酸转化率低，PHBV中3-羟基戊酸（3-hydroxyvalerate简称3HV）单体的比例很低，材料性能差。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌，是对生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为失活所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因；所述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因为2-甲基柠檬酸合成酶（PrpC）编码基因、PHA降解酶1（phaZ1）编码基因、PHA降解酶2（phaZ2）编码基因和PHA降解酶3（phaZ3）编码基因中的至少一种。

上述2-甲基柠檬酸合成酶（2-methylcitrate synthase）PrpC的核苷酸序列为序列表中的序列1；PHA降解酶1phaZ1、PHA降解酶2phaZ2、PHA降解酶3phaZ3的编码基因的核苷酸序列依次为序列表中的序列2，3，4。上述重组菌中，所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌为Halomonas sp.TD01，保藏号为CGMCC No.4353。

上述重组菌中，所述失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因为删除各种所述基因的全部编码框，即敲除各种所述基因的全部编码框。

本发明的另一个目的是提供一种构建上述重组菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的上述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因，得到的重组菌；

所述失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的所述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因具体通过同源重组实现。

上述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因为2-甲基柠檬酸合成酶编码基因、PHA降解酶1编码基因、PHA降解酶2编码基因和PHA降解酶3编码基因中的至少一种。

上述方法中，所述同源重组包括如下步骤：

1）将含有待敲除基因同源臂的DNA分子插入自杀质粒中，得到重组自杀质粒；

所述含有待敲除基因同源臂的DNA分子由在所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌基因组中待敲除基因的上下游两条同源臂组成；

2）将所述重组自杀质粒导入出发菌中，重组自杀质粒通过同源重组整合至基因组的特定位置，得到同源重组菌1；

3）将诱导质粒导入所述同源重组菌1中，诱导质粒表达的归位内切酶I-SceI在同源重组菌1基因组的6个I-SceI位点进行切割，产生双链的DNA缺口，能诱导二次同源重组的发生，即得到所述重组菌。

在上述方法的步骤3）中，还包括将诱导质粒导入所述同源重组菌1中得到的阳性克隆进行阿拉伯糖诱导，得到所述重组菌的步骤。

上述方法中，所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌为Halomonas sp.TD01，保藏号为CGMCC No.4353；