[发明专利]一株盐单胞菌多基因敲除株的构建和应用

权利要求书

1.一种重组菌，是对生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为失活所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因；所述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因为2-甲基柠檬酸合成酶编码基因、PHA降解酶1编码基因、PHA降解酶2编码基因和PHA降解酶3编码基因中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：

所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌为Halomonas sp.TD01，保藏号为CGMCCNo.4353。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：

所述失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因为删除各种所述基因的全部编码框。

4.一种构建权利要求1-3任一所述重组菌的方法，包括如下步骤：失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的所述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因，得到的重组菌；

所述失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的所述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因具体通过同源重组实现。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述同源重组包括如下步骤：

1）将含有待敲除基因同源臂的DNA分子插入自杀质粒中，得到重组自杀质粒；

所述含有待敲除基因同源臂的DNA分子由在所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌基因组中待敲除基因的上下游两条同源臂组成；

2）将所述重组自杀质粒导入出发菌中，得到同源重组菌1；

3）将诱导质粒导入所述同源重组菌1中，即得到所述重组菌。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：

在上述方法的步骤3）中，还包括将诱导质粒导入所述同源重组菌1中得到的阳性克隆进行阿拉伯糖诱导，得到所述重组菌的步骤；

所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌为Halomonas sp.TD01，保藏号为CGMCCNo.4353；

所述自杀质粒为带有6个I-SceI位点的自杀质粒pRE112-phaABC-6IsceI；

所述诱导质粒为表达归位内切酶I-SceI的质粒pMCS1-Spe-araC-ISceI。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：

所述同源重组中，步骤1）的所述待敲除基因为2-甲基柠檬酸合成酶编码基因，步骤2）的出发菌为所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌，步骤3）得到重组菌A。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：

所述同源重组中，步骤1）的所述待敲除基因为PHA降解酶1编码基因，步骤2）的出发菌为所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌，步骤3）得到重组菌B。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：对所述重组菌B进行权利要求5或6所述的方法中的同源重组，步骤1）的所述待敲除基因为PHA降解酶2编码基因，步骤2）的出发菌为所述重组菌B，步骤3）得到重组菌C。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：对所述重组菌C进行权利要求5或6所述的方法中的同源重组，步骤1）的所述待敲除基因为PHA降解酶3编码基因，步骤2）的出发菌为所述重组菌C，步骤3）得到重组菌D。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：对所述重组菌D进行权利要求5或6所述的方法中的同源重组，步骤1）的所述待敲除基因为2-甲基柠檬酸合成酶编码基因，步骤2）的出发菌为所述重组菌D，步骤3）得到重组菌E。

12.权利要求1-3中任一所述的重组菌在制备聚羟基丁酸戊酸共聚酯中的应用。

13.权利要求1-3中任一所述的重组菌在提高聚羟基丁酸戊酸共聚酯中3-羟基戊酸单体所占的摩尔百分比中的应用。

14.一种制备聚羟基丁酸戊酸共聚酯的方法，包括如下步骤：在含有丙酸的发酵培养基中发酵培养权利要求1-3中任一所述的重组菌，收集菌体，即得到聚羟基丁酸戊酸共聚酯。

15.权利要求14所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中的丙酸终浓度为0.5g/L-1g/L，所述发酵培养基中的丙酸终浓度具体为0.5g/L。

16.权利要求14或15所述的方法，其特征在于：

所述发酵培养基中含有氯化钠，所述氯化钠的浓度为250g/L以下，所述发酵培养基中氯化钠的浓度具体为60g/L。