[发明专利]单分子力谱分析用AFM探针和基底功能化修饰方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种探针和基底功能化修饰方法，特别是涉及一种单分子力谱分析用原子力显微镜探针和基底功能化修饰方法，属于微观科学领域，特别是纳米测量。

背景技术

时至今日，原子力显微镜单分子力谱已经成为研究生物分子间相互作用的强有里的工具，对于深入了解生物分子结构域功能的关系以及在生命科学过程中的作用具有重要意义，是目前生物、化学、物理交叉领域的一个前沿方向。单分子力谱研究中通常通过一段聚乙二醇（PEG）高分子聚合物链将蛋白质固定到原子力显微镜探针针尖和基底上，从而能保证生物分子的空间自由度，并且能从力-距离曲线图上将生物分子间特异性相互作用于针尖和基底的非特异性相互作用区分开。当前，研究主要是对原子力显微镜硅探针和金探针进行表面功能化修饰上蛋白质：1）通过双功能化PEG将生物分子链接到原子力显微镜硅探针表面上，该方法的缺点是PEG分子不能在硅探针上形成致密的PEG层，从而不能避免针尖和基底的非特异性相互作用；2）也有少量研究通过双功能化PEG将生物分子链接到原子力显微镜金探针表面上，首先将短的两端都带有巯基的烷基硫醇链接到金表面，从而在金表面形成暴露的巯基，随后通过双功能化的PEG高分子化合物MAL-PEG-NHS将生物分子链接到金表面上。该方法优点是PEG层致密，非特异性相互作用较少。缺点是步骤较为繁复，因而增加了金表面功能化失败的风险。因此构建一种简单的原子力显微镜金探针和基底功能化方法是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于原子力显微镜单分子力谱测量的探针和基底表面功能化方法，该方法步骤简单，操作简便，可以实现在单分子水平研究蛋白之间相互作用力及细胞表面单分子识别等的目标。

本发明的技术解决方案是：

本发明首先将一端氨基甲酸叔丁酯（Boc）基团保护另外一端为巯基的的PEG高分子偶联到金膜修饰的原子力显微镜探针或者金基底上，其次将蛋白的伯胺利用蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯 （SATA）或者N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP）修饰为巯基，最后将Boc保护基团脱除，并与巯基化的蛋白反应，从而将蛋白修饰到金探针和金基底上。

本发明提供一种单分子力谱分析用原子力显微镜探针和基底功能化修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步：在氯仿中清洗针尖镀金的原子力显微镜探针和金基底，探针和金基底，在氮气下干燥，紫外臭氧清洗，随后用超纯水清洗，氯仿清洗，氮气下干燥；

第二步：将清洗干净的金探针和金基底放入到氯仿为溶剂的氨基甲酸叔丁酯–聚乙二醇–巯基（Boc-PEG-3000-SH）和甲氧基–聚乙二醇–巯基（mPEG-2000-SH）混合液中避光反应；

第三步：在蛋白溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯 （SATA），或N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP），并反应一段时间；

第四步：在第三步得到的蛋白溶液中，加入脱乙酰缓冲液中反应，反应时间为0.5 ～3小时，随后利用脱盐柱脱去蛋白溶液中的盐；

第五步：取第二步得到的金探针和金基底放入到三氟乙酸中，超纯水清洗；

第六步：金探针和金基底放入到交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC），或4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）溶液中，反应一段时间，超纯水清洗；

第七步：金探针和金基底置入到第四步处理得到的蛋白溶液，反应，超纯水清洗，置入磷酸盐（PBS）缓冲液中4度保存备用。

所述原子力显微镜探针的针尖表面已经镀了一层金膜作为功能化修饰的基底。

第二步所述聚乙二醇混合液中Boc-PEG-3000-SH摩尔比率为0.5～10﹪，总聚乙二醇浓度为1～10mM，反应时间为12～24小时。

第三步所述蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯，或N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯先溶解于二甲基甲酰胺，或二甲基亚砜，随后再加入到蛋白溶液中，其与蛋白的摩尔比为10：1～250：1，反应时间为0.5 ～3小时。

第四步所述脱乙酰缓冲液为0.5M羟胺，25mM 乙二胺四乙酸（EDTA），PBS缓冲体系，pH为7.2～7.5。

第五步所述三氟乙酸反应时间为5～10分钟。