[发明专利]单分子力谱分析用AFM探针和基底功能化修饰方法

权利要求书

1.一种单分子力谱分析用原子力显微镜探针和基底功能化修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步：在氯仿中清洗针尖镀金的原子力显微镜探针和金基底，探针和金基底，在氮气下干燥，紫外臭氧清洗，随后用超纯水清洗，氯仿清洗，氮气下干燥；

第二步：将清洗干净的金探针和金基底放入到氯仿为溶剂的氨基甲酸叔丁酯–聚乙二醇–巯基（Boc-PEG-3000-SH）和甲氧基–聚乙二醇–巯基（mPEG-2000-SH）混合液中避光反应；

第三步：在蛋白溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯 （SATA），或N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP），并反应一段时间；

第四步：在第三步得到的蛋白溶液中，加入脱乙酰缓冲液中反应，反应时间为0.5 ～3小时，随后利用脱盐柱脱去蛋白溶液中的盐；

第五步：取第二步得到的金探针和金基底放入到三氟乙酸中，超纯水清洗；

第六步：金探针和金基底放入到交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC），或4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）溶液中，反应一段时间，超纯水清洗；

第七步：金探针和金基底置入到第四步处理得到的蛋白溶液，反应，超纯水清洗，置入磷酸盐（PBS）缓冲液中4度保存备用。

2.根据权利要求1所述单分子力谱分析用原子力显微镜探针和基底功能化修饰方法，其特征在于，所述原子力显微镜探针的针尖表面已经镀了一层金膜作为功能化修饰的基底。

3.根据权利要求1所述单分子力谱分析用原子力显微镜探针和基底功能化修饰方法，其特征在于，第二步所述聚乙二醇混合液中Boc-PEG-3000-SH摩尔比率为0.5～10﹪，总聚乙二醇浓度为1～10mM，反应时间为12～24小时。

4.根据权利要求1所述单分子力谱分析用原子力显微镜探针和基底功能化修饰方法，其特征在于，第三步所述蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯，或N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯先溶解于二甲基甲酰胺，或二甲基亚砜，随后再加入到蛋白溶液中，其与蛋白的摩尔比为10：1～250：1，反应时间为0.5 ～3小时。

5.根据权利要求1所述单分子力谱分析用原子力显微镜探针和基底功能化修饰方法，其特征在于，第四步所述脱乙酰缓冲液为0.5M羟胺，25mM 乙二胺四乙酸（EDTA），PBS缓冲体系，pH为7.2～7.5。

6.根据权利要求1所述单分子力谱分析用原子力显微镜探针和基底功能化修饰方法，其特征在于，第五步所述三氟乙酸反应时间为5～10分钟。

7.根据权利要求1所述单分子力谱分析用原子力显微镜探针和基底功能化修饰方法，其特征在于，第六步所述交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC），或4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，或者Sulfo-SMCC首先溶解于超纯水中，随后再将SMCC或者Sulfo-SMCC溶液加入到PBS缓冲体系中，浓度为0.1～2 mg/mL，反应时间为15～45分钟。

8.根据权利要求1所述单分子力谱分析用原子力显微镜探针和基底功能化修饰方法，其特征在于，第七步所述蛋白浓度为1～20μg/mL，反应的量为50～300μL，反应时间为0.5～3小时。