[发明专利]利用分子标记鉴定玉米互交种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种互交种的鉴定方法，尤其是一种利用分子标记鉴定玉米互交种的方法。

背景技术

玉米是我国乃至世界上重要的粮饲作物，在农业生产中具有重要地位。玉米能否正常生产关系着我国粮食生产安全。种子纯度是种子质量的重要指标之一，也是种子分级的主要依据。生产上造成玉米种子纯度降低的主要原因较多：隔离条件不充分、母本去雄去杂不彻底以及收获时的机械混杂等[薛艳颖, 陈兴奎,樊严, 陈小丹. SSR分子标记技术在杂交玉米种子纯度鉴定中的应用. 杂粮作物, 2007, 27(1): 6-7]。由此产生的种子混杂方式也多种多样，包括亲本自交种的混杂、其他品种的混杂及正交种、反交种的混杂等。传统品种纯度的检验方法主要依赖于品种的形态特征、生理特性及同工酶等指标。随着分子生物学的发展，分子标记技术越来越广泛的应用于品种纯度检测，国家和一些地方也相继出台了玉米品种纯度及真实性的分子标记检测方法，为玉米种子纯度的分子检测提供了标准。

玉米互交种是由两个不同的玉米亲本自交系以相反的交配顺序得到的，正交与反交是相对的，指定一种交配顺序获得的杂交种为正交种，则相反的交配顺序获得的杂交种为反交种。一般的正、反交种的表现型没有差异，但是对于受细胞质基因控制的母性遗传性状，正交种与反交种会表现出显著差异。尽管受母本控制的部分性状可作为形态学标记对部分互交种进行鉴定，但是利用分子标记鉴定是从根本上实现互交种判定的可靠方法。现行的玉米品种纯度的分子标记检测标准不能对互交种的混杂进行区分，主要原因在于该检测标准是建立在不同玉米品种基因组成是有差异的基础之上的。由于互交种的基因均来自相同的亲本，因此，互交种含有相同的基因，基因组之间不存在质的差异。因此，如果从DNA水平上对互交种进行判定，只能从基因剂量的角度进行挖掘。玉米胚乳是一个精子和两个极核融合后发育形成的组织，基因组含有两个拷贝的母本基因及一个拷贝的父本基因，来自母本与父本的等位基因具有二倍剂量关系，可以此作为利用分子标记区分互交种的基础。

Insertion/Deletion(InDel)标记作为一种有应用前景的遗传标记得到了研究者的关注[Dinakar B, Maureen D, Mike H, Robin W, Dave V, James C R, Scott V T, Antoni R. Insertion-deletion polymorphisms in 3′ regions of maize genes occur frequently and can be used as highly informative genetic markers. Plant Mol Biol, 2002, 48: 539-547]。尽管玉米品种纯度鉴定主要利用SSR分子标记[李晓辉, 李新海, 李文华, 王振华, 马凤鸣, 袁力行, 张世煌. SSR标记技术在玉米杂交种种子纯度测定中的应用.作物学报, 2003, 29(1): 63- 68；张华生, 王凤格, 赵久然, 易红梅, 李瑞媛, 杨国航, 王璐. 利用形态性状和SSR标记进行玉米品种的特异性鉴定.玉米科学, 2011, 19(3): 51- 55]，但InDel标记用于玉米品种纯度分析已有报道[张体付, 葛敏,韦玉才, 赵涵. 玉米功能性Insertion/Deletion（InDel）分子标记的挖掘及其在杂交种纯度鉴定中的应用. 玉米科学, 2012, 20(2): 64-68]。目前，InDel较多用于基因组多态性的评价[冯芳君, 罗利军, 李荧, 周立国, 徐小艳, 吴金红, 陈宏伟, 陈亮, 梅捍卫. 水稻InDel和SSR标记多态性的比较分析.分子植物育种, 2005, 3(5): 725- 730；申璐, 沈火林, 柴敏, 王银磊, 杨文才. 采用InDel和SSR标记分析番茄品种基因组DNA多态性.中国农业大学学报, 2011, 16(2):34- 42]，未见用于互交种判定的研究。玉米基因组中存在大量的InDel多态，据估计每309bp就有一个InDel[Vroh B I, McMullen M, Sanchez-Villeda H, Schroeder S, Gardiner J, Schaeffer M, Soderlund C, Wing R, Fang Z, Coe J E. Single nucleotide polymorphisms and insertion-deletions for genetic markers and anchoring the maize fingerprint contig physical map. Crop Sci, 2006, 46: 12-21]。随着玉米基因组测序及重测序工作的完成，玉米InDel多态性标记得到了更快的发展[Schnable P S, Ware D, Fulton R S, Schnable P S, Ware D, Fulton R S, Stein J C, Wei F S, Pasternak S, Liang C Z , Zhang J W, Fulton L , Graves T A, Minx P, Reily A D, Courtney L, Kruchowski S S, Tomlinson C, Strong C, Delehaunty K, Fronick C, Courtney B, Rock S M, Belter E, Du F, Kim K, Abbott R M, Cotton M, Levy A, Marchetto P, Ochoa K, Jackson S M, Gillam B, Chen W, Yan L, Higginbotham J, Cardenas M, Waligorski J, Applebaum E, Phelps L, Falcone J, Kanchi K, Thane T, Scimone A, Thane N, Henke J, Wang T, Ruppert J, Shah N, Rotter K, Hodges J, Ingenthron E, Cordes M, Kohlberg S, Sgro J, Delgado B, Mead K, Chinwalla A, Leonard S, Crouse K, Collura K, Kudrna D, Currie J, He R, Angelova A, Rajasekar S, Mueller T, Lomeli R, Scara G, Ko A, Delaney K, Wissotski M, Lopez G, Campos D, Braidotti M, Ashley E, Golser W, Kim H, Lee S, Lin J, Dujmic Z, Kim W, Talag J, Zuccolo A, Fan C, Sebastian A, Kramer M, Spiegel L, Nascimento L, Zutavern T, Miller B, Ambroise C, Muller S, Spooner W, Narechania A, Ren L, Wei S, Kumari S, Faga B, Levy M J, McMahan L, Buren P V, Vaughn M W, Ying K, Yeh C, Emrich S J, Jia Y, Kalyanaraman A, Hsia A, Barbazuk W B, Baucom R S, Brutnell T P, Carpita N C, Chaparro C, Chia J, Deragon J, Estill J C, Fu Y, Jeddeloh J A, Han Y, Lee H, Li P, Lisch D R, Liu S, Liu Z, Nagel D H, McCann M C, SanMiguel P, Myers A M, Nettleton D, Nguyen J, Penning B W, Ponnala L, Schneider K L, Schwartz D C, Sharma A, Soderlund C, Springer N M, Sun Q, Wang H, Waterman M, Westerman R, Wolfgruber T K, Yang L, Yu Y, Zhang L, Zhou S, Zhu Q, Bennetzen J L, Dawe R K, Jiang J, Jiang N, Presting G G, Wessler S R, Aluru S, Martienssen R A, Clifton S W, McCombie W R, Wing R A, Wilson R K. The B73 maize genome: complexity, diversity, and dynamics. Science, 2009, 326: 1112-1115； Lai J S, Li R Q, Xu X, JinW W,Xu M M, Zhao H N, Xiang Z K, Song W B, Ying K, Zhang M, Jiao Y P, Ni P X, Zhang J G, Li D, Guo X S, Ye K X, Jian M, Wang B, Zheng H S, Liang H Q, Zhang X Q, Wang S C, Chen S J, Li J S, Fu Y, Springer N M, Yang H M, Wang J, Dai J R, Schnable P S, Wang J. Genome-wide patterns of genetic variation among elite maize inbred lines. Nat Genet, 2010, 42(11): 1027-1030]。InDel标记多态是一种扩增片段长度多态，从几个碱基对到几十个碱基对甚至上百个碱基对不等。对于差异较大的InDel标记的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳即可分辨出长度差异。