[发明专利]利用分子标记鉴定玉米互交种的方法

权利要求书

1.一种利用分子标记鉴定玉米互交种的方法，包括，提取玉米待检互交种DNA，提取的DNA样本测定浓度并用琼脂糖凝胶检测质量；根据待检亲本全基因组序列及基因组二代测序序列存在的差异发展InDel标记，通过PCR扩增，筛选出亲本叶片DNA之间存在共显性差异的InDel标记，其特征在于：

a、提取玉米待检互交种胚乳、叶片及其亲本叶片DNA，提取的DNA样本测定浓度并用琼脂糖凝胶检测质量；

b、根据待检互交种亲本全基因组序列及基因组二代测序序列存在的差异发展InDel标记，通过PCR扩增，筛选出亲本叶片DNA之间存在共显性差异的InDel标记；

c、以互交种叶片DNA为模板进行PCR扩增并对琼脂糖凝胶电泳条带进行图像识别以分析等位基因扩增质量，识别图像曲线圆滑、波峰波谷独立且互交种等位基因识别图像一致的共显性InDel标记被确定为鉴定互交种的分子标记；

 d、利用确定的共显性InDel标记对待检互交种胚乳及叶片DNA进行同一批次PCR扩增，PCR循环数应为处于指数扩增期且在琼脂糖凝胶上能够清晰表现扩增条带的PCR循环数；

e、对等位基因扩增产物的电泳条带进行定量分析，获得待检互交种叶片及胚乳DNA等位基因扩增产物相对量的实测值，并由叶片DNA等位基因扩增产物相对量的实测值获得胚乳DNA等位基因扩增产物相对量的理论值，当X_A^'/X_a^'=2                                               /时获得正交种胚乳等位基因扩增产物相对量的理论值，当X_A^'/X_a^'=0.5/时获得反交种胚乳等位基因扩增产物相对量的理论值，式中：

X_A^'/X_a^'分别为正交种或反交种胚乳等位基因扩增产物相对量的理论值；

/为同一批次互交种叶片等位基因扩增产物相对量实测值重复间的平均值；

f、利用卡方测验对待检互交种胚乳等位基因扩增产物相对量的实测值与其理论值进行统计分析，计算概率P，若实测值与正交种胚乳等位基因扩增产物相对量理论值的统计概率P>0.05且与反交种胚乳等位基因扩增产物相对量理论值的统计概率P≤0.05，则判定为正交种，反之则为反交种。

2.根据权利要求1所述的利用分子标记鉴定玉米互交种的方法，共显性InDel分子标记是这样获得的：二代原始序列经过整理后，删除在另一亲本全基因组序列中对应多个位点的二代测序序列，再根据InDel差异发展标记，通过PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，筛选亲本基因组间存在共显性差异的InDel标记。

3.根据权利要求1所述的利用分子标记鉴定玉米互交种的方法，其特征在于，所述的待检互交种胚乳及叶片DNA进行同一批次PCR扩增是指：利用相同的InDel标记对待检互交种胚乳及叶片DNA同时进行扩增，在PCR反应体系配制时采用统一混合然后分装的方法，即根据总反应量先混合除DNA模板以外的所有PCR组分形成PCR反应混合液，然后按照待检互交种胚乳及叶片DNA模板的样本量分装PCR反应混合液，在分装的混合液里加入相应的待检互交种胚乳或叶片DNA模板形成完整的PCR反应体系，将完整的PCR反应体系分装为若干重复即可在同一台PCR仪器上以相同的PCR程序进行扩增，这样可使同一标记在互交种叶片DNA及互交种胚乳DNA中等位基因扩增效率保持稳定，即可利用互交种叶片等位基因扩增产物相对量实测值获得互交种胚乳等位基因扩增产物相对量的理论值。

4.根据权利要求1所述的利用分子标记鉴定玉米互交种的方法，其特征在于，所述的PCR循环数应为处于指数扩增期且在琼脂糖凝胶上能够清晰表现扩增条带的PCR循环数是指：对相应标记以不同的循环数进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳时随着循环数的增加扩增条带的亮度逐渐增强，则该PCR阶段处于指数扩增期，以该阶段在琼脂糖凝胶上能够清晰表现扩增条带的PCR循环数作为鉴定玉米互交种的PCR循环数。