[发明专利]NOX4敲减的A375稳转细胞株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域。

背景技术

NADPH氧化酶由NOX、p47^phox、p67^phox、p40^phox、Rac和p22^phox等亚基组成（图1）。NOX是NADPH氧化酶的功能核心亚基，包含6个跨膜区(Ⅰ-Ⅵ)，跨膜区Ⅲ和Ⅴ之间结合两个亚铁血红素(Heme)，羧基端含有FAD和NADPH的结合位点；NOX结合NADPH后，电子沿NADPH→FAD→亚铁血红素→O2的方向传递；NADPH氧化酶依赖于NOX将电子从供体NADPH传递给受体O₂，生成O₂^－。（图2）。1986年，Royer-Pokora等克隆出吞噬细胞内发挥电子传递作用gp91^phox亚基的基因，该基因被命名为NOX2。随后相继发现NOX家族的其他成员，包括：NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2。NOX家族各成员具有高度保守的同源结构，同源结构与其电子传递功能密切相关。人NOX4基因定位于11号染色体（11q14.2-q21），基因全长265,259 bp, 由18个外显子和17个内含子组成； 其cDNA 为1737 bp, 编码578个氨基酸。

NOX家族成员分布于人黑色素瘤、结肠癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌和肺癌等肿瘤，并且与肿瘤的形成、增殖和凋亡密切相关。Arnold等构建出NOX1高表达的小鼠成纤维细胞NIH 3T3，NOX1的高表达导致NIH 3T3细胞中ROS水平增高，细胞的生长特性发生改变，具体表现为增殖能力提高，密度依赖性生长抑制作用丧失，将NOX1高表达的NIH 3T3细胞注射到裸鼠皮下后，该细胞具有成瘤能力。Brar等通过RT-PCR和免疫染色等方法发现NOX4存在于人黑色素瘤细胞M1619中。通过反义RNA技术抑制M1619细胞中NOX4的表达，或用NOX的抑制剂二联苯碘(Diphenylene iodonium, DPI)处理M1619细胞后，肿瘤细胞内ROS水平降低，NF-κB(Nuclear factor-kappa B)、ATF-1/2(Activating transcription factor-1/2)和CREB-1(cAMP response element binding protein-1)等转录因子的功能降低，肿瘤细胞增殖能力下降。Yamaura等发现在13种人黑色素瘤细胞中NOX4的表达量都增加并伴随细胞内ROS水平增高，通过siRNA方法敲减人黑色素瘤细胞MM-BP中NOX4后，细胞内ROS水平降低，肿瘤细胞增殖能力下降，裸鼠皮下成瘤能力下降。Zhao等用DPI处理小鼠黑色素瘤细胞B16后，细胞内ROS水平下降，肿瘤细胞的增殖能力下降，并且还发现DPI能促进B16细胞的分化。Lu等用NOX的抑制剂夹竹桃麻素(Apocynin)处理人前列腺癌细胞22Rv1后发现，肿瘤细胞内ROS水平降低，肿瘤细胞对放疗的敏感性增强。可见，NOX与肿瘤的发生、发展、临床表现及治疗均有密切关系。

至今为止，文献报道的NOX4敲减的人黑色素瘤细胞有1个来源。Yamaura等将能表达siNOX4-1(5'-CAGAACATTCCATATTAC-3')或siNOX4-2(5'-ACTTT GTTGAACTGAATG-3')的DNAN模板插入含H1启动子的表达载体pSilencer hygro形成重组载体，通过Lipofectamine 2000介导重组载体转染人黑色素瘤MM-BP细胞。因pSilencer hygro携带潮霉素(Hygromycin)抗性，所以用含Hygromycin 400 μg/ml的培养基筛选转染后的细胞，从而获得阳性细胞株，再通过RT-PCR和Western Blot检测NOX4的干扰效率。此外，Brar等通过反义核苷酸技术将靶向NOX4 mRNA的正义核苷酸链(5'-TCGAGGAGGTCCTGTGTCGG-3')或反义核苷酸链(5'- AGCTCCTCCAGGACACAGCC-3')转染M1619细胞后，经反义核苷酸链转染后的M1619细胞增殖能力下降，NF-κB、ATF-1/2和CREB-1等转录因子的活性下降。但是反义核酸链介导NOX4表达下降是短期的效应并不能长期维持，而且并未检测转染后NOX4 mRNA和蛋白表达水平，故这株M1619细胞不能确定为NOX4敲减的细胞。