[发明专利]NOX4敲减的A375稳转细胞株及其构建方法

权利要求书

1.一种NOX4敲减的A375稳转细胞株，其特征在于是利用逆转录病毒载体pSuper.retro.puro将模板DNA双链中的F链5'-GATCCCCGGGCTAGGATTGTGTCTAAGCTTCAAGAGAGCTTAGACACAATCCTA GCCCTTTTTA-3'和R链5'-AGCTTAAAAAGGGCTAGGATTGTGTCTAAGCTCTCTTGAAGCTTA GACACAATCCTAGCCCGGG-3'插入进A375细胞基因组，经转录后生成的干扰RNA靶向降解A375细胞内源性NOX4 mRNA，靶向沉默内源性NOX4表达，进而靶向敲减A375细胞内源性NOX4表达80%以上的稳转细胞株。

2.如权利要求1所述的NOX4敲减的A375稳转细胞株的构建方法由以下步骤组成：

(一)、 设计合成shRNA序列 

利用BLOCK-iT? RNAi Designer设计针对人NOX4基因NM_016931的3组shRNA序列NOX4-shRNA 1、NOX4-shRNA 2、NOX4-shRNA 3和1组无关对照序列Scramble-shRNA，每组序列包括2条DNA单链，即F链和R链，每条DNA单链含有针对人NOX4基因的正义和反义干扰序列、9个核苷酸的Loop结构以及两端限制性内切酶Bgl Ⅱ或Hind Ⅲ的酶切位点；

(二)、 构建逆转录病毒表达载体pSuper.retro.puro-NOX4-shRNA

按设计合成DNA模板单链F链和R链，退火形成双链模板，用Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切逆转录病毒表达载体pSuper.retro.puro后成为线性质粒；退火后的双链DNA模板与线性载体pSuper.retro.puro在T4 DNA 连接酶作用下连接形成重组载体，重组载体转化E.coli DH5α感受态细菌，将转化菌液涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基平板，过夜培养；挑选阳性菌落扩增培养，提取质粒测序鉴定重组载体pSuper.retro.puro-NOX4-shRNA是否构建成功；

(三)、 pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA载体的干扰效率筛选

Lipofectamine 2000 分别介导重组干扰载体pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA 1, 2, 3和pSuper-retro-puro-scramble-shRNA 瞬时转染A375-WT 细胞，转染48 小时 后收集细胞并提取总RNA和总蛋白，以β-actin 作为内参，分别用于荧光定量PCR 和Western Blot 检测NOX4的表达；

(四)、逆转录病毒包装和生产

病毒包装质粒和重组载体pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA 1通过磷酸钙法共转染293FT细胞，6 小时后取出培养皿，弃去培养基，1×PBS清洗细胞3次，并轻柔地加入8 ml新鲜的293FT培养基，继续培养；细胞转染36-48 小时后，收集培养基上清液作为逆转录病毒液，之后每3 小时收集1次，共收集3-4次，每次收集的病毒上清液用0.45 μm的PVDF膜过滤；

(五)、逆转录病毒感染A375细胞

胰酶消化处于生长对数期的A375细胞，离心后用无抗生素的培养基重悬细胞，取5×10⁵个A375细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，向培养皿中加入2 ml温浴后的病毒上清液，加入聚凝胺Polybrane，终浓度为2 μg/ml，培养3 小时，弃去培养基，更换2 ml病毒上清液继续培养，重复2次；

(六)、A375-NOX4?稳转细胞筛选和鉴定

A375细胞经病毒上清液感染3次后，向培养皿中加入无抗生素的培养基，培养48小时后，弃去培养基，换用含嘌呤霉素的培养基培养并筛选阳性细胞，隔日观察细胞，弃去原培养基及死细胞，1×PBS清洗细胞3次，更换抗性培养基继续培养细胞，持续筛选10 天，待细胞长满时，消化细胞，接种于10 mm培养皿中扩增培养，传代3次；筛选结束后通过荧光定量PCR和Western Blot检测NOX4 mRNA和蛋白表达；与A375细胞相比，筛选所得细胞的NOX4 mRNA和NOX4蛋白分别下降66.11 %和82.63 %，表明NOX4敲减的A375-NOX4?稳转细胞株构建成功。