[发明专利]一种提高烟草烟叶钾含量的育种方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高烟草烟叶钾含量的育种方法。

背景技术

根据大量资料统计，钾是烤烟吸收量和体内含量最高的营养元素，也是影响我国烤烟质量进一步提高的重要限制因素。而我国大多数植烟土壤不能提供充足的钾供给烤烟以满足优质烟叶生产的需求。因此，生产上需要投入大量的钾肥。连年大量施用化肥，不但增加烟农的生产成本，而且加速土壤理化性质的恶化。遗憾的是我国优质烟叶平均钾含量依然较低，与国外优质烟叶相比至少还低20%以上（我国优质烟叶2%左右，国外优质烟叶大2.5%）。影响烤烟体内钾含量的因素有许多，主要有：土壤和气候；栽培措施；品种或基因型等。土壤和气候是自然形成的，人类较难改变。栽培措施提高烟叶钾含量，多年实践证明有一定的局限性，何况再增加钾肥用量也不可取。因此，选育高钾含量烤烟新品种将是解决烤烟钾含量的关键途径之一。

然而常规育种存在远缘杂交不亲合、杂种性状不稳定、分离世代长等问题；体细胞杂交技术虽然在一定程度上克服了杂交不亲合现象，但存在再生频率低、变异后代群体小、体细胞无性系变异、遗传不稳定等问题；自Hess提出花粉粒可以吸收外源DNA的研究报道以后，总DNA导入技术在作物育种中得到广泛应用，它逾越了常规育种中的生殖障碍，弥补了细胞工程技术繁琐、植株再生频率低、后代群体小，难以筛选等缺陷，在目前烟草遗传背景尚不明了、优良基因来源有限、转基因研究仍受到贸易壁垒负面影响的形势下，不失为一条切实可行的品种改良的捷径。

利用带有目的基因的供体植物DNA（包括远缘供体DNA）直接转化受体，筛选目的性状变异后代，培育农作物新品种的方法，是植物基因工程与分子生物技术在农业育种上的实际应用。花粉管通道法是利用植物开花受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精细胞。近年来，我国已通过此技术在棉花、大豆、水稻、小麦、烟草等多种作物上获得成功。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种花粉管通道法，将高钾植物商陆的总基因组DNA导入到烤烟品种红花大金元中，以期获得高钾含量烤烟的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的，其步骤如下：

一种提高烟草烟叶钾含量的育种方法：利用花粉管通道法将高钾植物商陆的总体DNA导入烟草品种红花大金元（从中国烟草中南试验站购买）中进行栽培，具体包括以下步骤：

（1）供体DNA的提取：取0.2g幼嫩烟草冰冻叶片入砚钵中→加入2×CTAB提取液700μl研磨后转入1.5ml离心管→于65℃保温20-30min→冷却后加入等体积的氯仿：异戊醇混匀10min→10000r/min离心10min→取上清液至一新管→加入100μl 5M NaCl和1ml冰冷乙醇沉淀DNA→挑出DNA沉淀，用70%乙醇洗净干燥→溶解于100μlTE中；所述的2×CTAB提取液配方为：2%CTAB，1.4M NaCl，100mM Tris-HCl，100mM EDTA，pH8.0，2%β-巯基乙醇；所述的氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；

（2）导入方法：选择生长健壮、主茎中上部已开放的花朵，将其花冠褪下，露出柱头，然后用左手拇指甲做砧板托住柱头，右手拿刀片沿与柱头成45℃角切除1/4～1/3柱头，最后将DNA提取液滴于柱头上，再将花冠戴上；导入时间从早晨6:00花初放开始，然后每一小时导入一次，至下午4:00花凋萎止。

所述的提高烟草烟叶钾含量的育种方法中，将高钾植物商陆的总体DNA导入烟草品种后，再以烟草烟叶钾含量不低于2%的标准进行筛选。

烟叶钾含量测定：在烟株成熟期时，每个处理选取有代表性的植株6株整株收获，洗净后在105℃下杀青30min，然后在80℃下烘干，粉碎过筛，将0.45mm筛的样品0.1g置于150mL三角瓶中，加5%乙酸100mL，塞上橡皮塞，在摇床或振荡器上振荡萃取30min，用定性滤纸过滤，弃去前几毫升滤液，收集后续滤液，最后用原子吸收光谱仪测定钾的浓度。