[发明专利]高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术及生物制品领域，特别涉及一种高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法。

背景技术

光合细菌（Photosynthetic Bacteria Abbr，简称PSB)是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核生物，是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，是一类没有形成芽孢能力的革兰氏阴性菌，是一类以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。光合细菌广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处，主要分布于水生环境中光线能透射到的缺氧区。

目前已开发出多种光合细菌的制种方法和制种装置，涉及到的专利有“一种用于规模生产高细胞浓度光合细菌的方法”（公开号CN101386820），“光合细菌制剂的制备方法”（公开号 CN1384188），“光合细菌制剂的制备方法”（公开号CN1400303），“一种制种光合细菌的方法”（公开号CN101358178），“一种浓缩光合细菌的制备方法”（公开号CN1861784），“光合细菌高效制备方法”（公开号CN1597925）。

从上述申请的专利可以看出，目前光合细菌生产企业及科研单位大多集中精力研究光合细菌的大规模生产，在扩繁环节煞费苦心，而对菌种本身没有足够重视，结果造成菌体活性降低、生长速度减慢、杂菌率增高，最终无法保证活菌数，影响使用效果。

术语解释

光合细菌原代菌种：本发明中是指用于大规模生产用的菌种或实验室培养出来的光合细菌菌种。

10倍梯度稀释法：梯度稀释法就是依次稀释10倍，比如取1mL原液加入9mL水稀释10倍，再从这里面取1mL与9mL水混和，依次类推，称梯度稀释。

双层平板法：又叫双层琼脂平板法，先在培养皿中加入混有菌的底层固体培养基，待凝固后再加入半固体培养基。培养一段时间后，观察下层培养基中的菌落数。

菌落：将单个细菌细胞或一小堆同种细胞接种到固体培养基表面（或内层），当它占有一定的发展空间并处于适宜的培养条件下时，该细胞就会迅速生长繁殖并形成细胞堆，即菌落。

单菌落：单菌落是指来源于单一孢子或营养细胞或一群相同的细胞在固体培养基表面或内部形成的肉眼可见的集合体。

纯菌落：菌种单一的菌落。与单菌落的区别在于单菌落可以是不同细胞集合在一起形成的菌落，而纯菌落的话绝对是一个细胞生长繁殖形成的菌落，也称为单克隆。

全价光合细菌培养基：全价光合细菌培养基是指营养价值全面，能满足光合菌生长需求的配合式培养基。

发明内容

针对上述不足之处，本发明的目的之一就在于提供一种高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，该高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法制种的光合细菌原代菌种生长迅速，培养3~5d后OD_660nm值即可达到1.5以上，杂菌率低，（＜5%），活菌数高（＞10^10~12cfu/ml）。

技术方案是：一种高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，该高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法包括以下步骤：1) 菌种分离、纯化；2) 种子筛选。

作为优选，该高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法还包括原代菌种保存步骤。

作为优选，所述菌种分离、纯化步骤包括以下分步骤：

①光合细菌菌液采用梯度稀释法稀释；

②称取光合细菌双层平板法下层培养基组分，加入0.2~0.6%琼脂，加热融化，冷却至40~45℃；

③取适宜稀释度稀释液，按照稀释液与培养基1:5~1:7比例，将稀释液和培养基混匀，倒入无菌培养皿，冷却凝固；

④按照光合细菌双层平板法，配制上层培养基，冷却至室温，注满培养皿，加盖，倒置，置于30~40℃，40~70W白炽灯光照条件下培养；

⑤待长出红色单菌落后，去掉上层培养基，用接种环挑取单菌落，接入装有无菌水的Ep管中打散，混匀。按照双层平板法重复操作三次，获得单克隆纯菌落进行下一步操作。整个操作均在无菌超净台进行，保证无菌。

作为优选，所述原代菌种保存为菌种保存于培养架上层，无阳光直射，保持散射光源，同时持续处于间隔20~40min自动持续搅拌1~5min。

作为优选，所述种子筛选步骤包括以下分步骤：

① 培养基制备；

② Ep管培养；

③ 试管培养；

④ 一级种子培养；