[发明专利]高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法

权利要求书

1.一种高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于该高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法包括以下步骤：

1) 菌种分离、纯化；

2) 种子筛选。

2.根据权利要求1所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征还包括以下步骤：原代菌种保存。

3.根据权利要求1或2所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于所述菌种分离、纯化步骤包括以下分步骤：

①光合细菌菌液采用梯度稀释法稀释；

②称取光合细菌双层平板法下层培养基组分，加入0.2~0.6%琼脂，加热融化，冷却至40~45℃；

③按照稀释液与培养基1:5~1:7比例，将稀释液和培养基混匀，倒入无菌培养皿，冷却凝固；

④按照光合细菌双层平板法，配制上层培养基，冷却至室温，注满培养皿，加盖，倒置，置于30~40℃，40~70W白炽灯光照条件下培养；待长出红色单菌落后，去掉上层培养基，用接种环挑取单菌落，接入装有无菌水的Ep管中打散，混匀；

⑤按照双层平板法重复操作三次，获得单克隆纯菌落；

⑥整个操作均在无菌超净台进行，保证无菌。

4.根据权利要求3所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于所述原代菌种保存为：菌种保存于培养架上层，无阳光直射，保持散射光源，同时持续处于间隔20~40min自动持续搅拌1~5min。

5.根据权利要求1或2所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于所述种子筛选步骤包括以下分步骤：

① 培养基制备；

② Ep管培养；

③ 试管培养；

④ 一级种子培养；

⑤ 二级种子培养或扩大培养；

⑥ 三级种子培养。

6.根据权利要求5所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于：

所述培养基制备为按比例称量培养基配方各成分。

7.培养基配方为NaAc 2~5g/L、NH₄Cl 0.1~2g/L、NaHCO₃ 0.4~3g/L、KH₂PO₄ 0.01~1g/L、NaCl 0.5~3g/L、MgCl₂ 0.05~2g/L、酵母膏0.1~2.5g/L。

8.其中除NH₄Cl和NaHCO₃外培养基成分100~121℃，灭菌15~30min；NH₄Cl和NaHCO₃配制成10倍母液，真空抽滤灭菌，以1:6~1:9添加到其余组分中制成无菌全价光合细菌培养基；

所述Ep管培养为去掉双层平板中的上层培养基，挑取单克隆菌体转接至含有无菌培养基的Ep管中，置于培养箱中30~40℃，40~70W白炽灯光照条件下培养，间隔2h~4h震荡一次，防止菌体附壁影响生长；从第4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株；

所述试管培养为将Ep管中筛选得到的菌体转接至无菌试管，加满无菌培养基，密封管口；

所述一级种子培养为向无菌小型锥形瓶中加入无菌培养基，按照接种比例将试管培养筛选留下的菌体转接进去，瓶口密封；培养4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株；

所述二级种子培养为向无菌中型锥形瓶中加入无菌培养基，按照接种比例将一级种子筛选留下的菌体转接进去，瓶口密封；培养4~7d开始淘汰长势不佳的菌体，保持淘汰率80~90%左右，以获得最优菌株；所述扩大培养为将选出的二级菌种按比例接种至500mL锥形瓶进行培养；

所述三级种子培养为按照1：10的比例，向装有5L培养基的大型锥形瓶中加入500mL筛选出的二级种子；放入一颗经过消毒处理的磁力转子，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧；移上光合细菌原代菌种培养架，室温，40~70W白炽灯光照下培养；培养架参数设置为间隔20~40min自动持续搅拌1~5min，防止菌体附壁影响生长。

9.根据权利要求6所述的高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法，其特征在于：所述原代菌种保存为菌种保存于培养架上层，无阳光直射，保持散射光源，同时持续处于间隔20~40min自动持续搅拌1~5min。