[发明专利]脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种ELISA试剂盒，具体地，涉及一种脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒。

背景技术

对于脂环酸芽孢杆菌的检测，通常采用细菌分离培养和生化鉴定的方法。该方法检测耗时长、成本高，对操作者的实验水平有较高的要求，这些都无法满足日常生产监测的实际要求。本发明采用的间接ELISA检测方法是免疫荧光方法的改进，具有快速定性和定量、灵敏度高、适用范围广、结果判定客观、成本低和可同时进行数千份样品的检测等优点，因此该方法已经面世，便被迅速推广。从而沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌0157:H7、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等食源性微生物的ELISA检测方法被广泛的应用在实验室和生产检验中。目前，国内外还没有建立针对脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测方法，与传统检测方法相比，该方法具有检测耗时较短和操作简单的优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒填补了国内还没有建立针对脂环酸芽孢杆菌的ELISA检测方法的空白，且具有较高的灵敏度和特异性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，包括以下试剂：

（1）包被液：将1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃加水充分溶解后，将pH调到9.6后，加去离子水定容为1L；

（2）PBS缓冲液：将准确称量8g NaCl、0.2g KCl、1.42g Na₂HPO₄和0.27g KH₂PO₄充分溶液在800mL去离子水中，然后滴加HCl将pH值调节到7.4，然后加去离子水定容至1L；

（3）PBST洗涤液：向1L PBS缓冲液中加入500μL Tween-20；

（4）检测抗体稀释液：取10mL 37℃过夜培养的大肠杆菌菌液，12000rpm离心3min收集菌体，用PBS洗涤两次后，加入3mL PBS重悬菌体，超声破碎30min，超声5s、间隔5s；将超声破碎后的液体在4℃，12000rpm离心30min，收集的上清为大肠杆菌裂解，即检测抗体稀释液；

（5）封闭液：1%牛血清白蛋白BSA；

（6）终止液：由10.87mL的浓硫酸与89.13mL的去离子水混合配制成的2M H₂SO₄；

（7）包被抗原：菌体蛋白，浓度为20μg/mL；

（8）检测抗体：脂环酸芽孢杆菌的兔抗血清，即脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体，采用检测抗体稀释液稀释，稀释度为1:320；

（9）酶标二抗：辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗兔IgG，采用PBS稀释，稀释度为1：10000；

（10）显色液：TMB显色液。

具体地，步骤（7）所述的包被抗原的制备方法，包括以下步骤：

将脂环酸芽孢杆菌接种到10mL的K氏培养液中，在220rpm，42℃条件下进行活化培养后，12,000rpm离心3min收集菌体，用PBS洗涤两次，加入3mL的PBS重悬菌体，在冰浴条件下超声破碎30min，其中超声5s，间隔5s；将超声破碎后的液体在4℃，12,000rpm离心30min，收集的上清即为包被抗原，并用紫外分光光度计测定上清液中总蛋白的浓度。

具体地，步骤（8）所述的脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）选取健康的雄性大白兔2只，适应一周后，进行免疫，其中一只注射制备的包被抗原，另一只注射PBS作为空白对照。一免2周后进行二免，以后每隔一周免疫一次，一共免疫4次；第一次免疫时将免疫蛋白溶液与弗氏完全佐剂1:1的比例进行乳化，其他三次均为弗氏不完全佐剂，免疫方式为皮下多点注射；

（2）对于后期血清的大量采取选择心脏采血，整个采血过程需要无菌操作；将采取的血样放置于37℃温箱1h，再放置于4℃中放置5h后1,500rpm离心30min，将上清用移液枪吸到另一个灭菌的离心管中，分装后-20℃冰箱中保存备用。

具体地，脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，所述包被抗原的条件为4℃包被过夜或37℃包被2h。

具体地，脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，所述酶标二抗的工作条件为37℃孵育60min。