[发明专利]脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

（1）包被液：将1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃加水充分溶解后，将pH调到9.6后，加去离子水定容为1L；

（2）PBS缓冲液：将准确称量8g NaCl、0.2g KCl、1.42g Na₂HPO₄和0.27g KH₂PO₄充分溶液在800mL去离子水中，然后滴加HCl将pH值调节到7.4，然后加去离子水定容至1L；

（3）PBST洗涤液：向1L PBS缓冲液中加入500μL Tween-20；

（4）检测抗体稀释液：取10mL 37℃过夜培养的大肠杆菌菌液，12000rpm离心3min收集菌体，用PBS洗涤两次后，加入3mL PBS重悬菌体，超声破碎30min，超声5s、间隔5s；将超声破碎后的液体在4℃，12000rpm离心30min，收集的上清为大肠杆菌裂解，即检测抗体稀释液；

（5）封闭液：1%牛血清白蛋白BSA；

（6）终止液：由10.87mL的浓硫酸与89.13mL的去离子水混合配制成的2M H₂SO₄；

（7）包被抗原：菌体蛋白，浓度为20μg/mL；

（8）检测抗体：脂环酸芽孢杆菌的兔抗血清，即脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体，采用检测抗体稀释液稀释，稀释度为1:320；

（9）酶标二抗：辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗兔IgG，采用PBS稀释，稀释度为1：10000；

（10）显色液：TMB显色液。

2.权利要求1的步骤（7）所述的包被抗原的制备方法，包括以下步骤：

将脂环酸芽孢杆菌接种到10mL的K氏培养液中，在220rpm，42℃条件下进行活化培养后，12,000rpm离心3min收集菌体，用PBS洗涤两次，加入3mL的PBS重悬菌体，在冰浴条件下超声破碎30min，其中超声5s，间隔5s；将超声破碎后的液体在4℃，12,000rpm离心30min，收集的上清即为包被抗原，并用紫外分光光度计测定上清液中总蛋白的浓度。

3.权利要求1的步骤（8）所述的脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）选取健康的雄性大白兔2只，适应一周后，进行免疫，其中一只注射制备的包被抗原，另一只注射PBS作为空白对照，

一免2周后进行二免，以后每隔一周免疫一次，一共免疫4次；第一次免疫时将免疫蛋白溶液与弗氏完全佐剂1:1的比例进行乳化，其他三次均为弗氏不完全佐剂，免疫方式为皮下多点注射；

（2）对于后期血清的大量采取选择心脏采血，整个采血过程需要无菌操作；将采取的血样放置于37℃温箱1h，再放置于4℃中放置5h后1,500rpm离心30min，将上清用移液枪吸到另一个灭菌的离心管中，分装后-20℃冰箱中保存备用。

4.根据权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被抗原的条件为4℃包被过夜或37℃包被2h。

5.根据权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗的工作条件为37℃孵育60min。

6.根据权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒在检测底物时的反应时间为室温条件下10min。

7.权利要求1、4、5、6任意一项所述脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒在脂环酸芽孢杆菌检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，用包被液按1:10稀释待测样本，每孔加入100ul稀释好的样本，用封口膜封住反应孔，37℃温箱孵育2小时；

（2）取掉封口膜，每孔加满洗涤液，加入后静置2分钟后扣除液体，重复操作3次，最后一次拍干；

（3）每孔加入100 ul封闭液，用封口膜封住反应孔，37℃温箱孵育2小时；

（4）同步骤“2”；

（5）每孔加入100ul 1:320稀释的检测抗体，37℃温箱孵育1小时；

（6）同步骤“2”；

（7）加入工作浓度的酶标二抗，每孔100 ul，用封口膜封口，37℃温箱孵育1小时；

（8）取掉封口膜，每孔加满洗涤液，加入后静置2分钟后扣除液体，重复操作5次，最后一次拍干；

（9）加入显色液TMB 100ul/孔，避光37℃孵箱，避光孵育15分钟；

（10）加入终止液100ul/孔，混匀后即刻置于酶标仪中450nm测量每孔的OD；

（11）判断标准：样本OD值大于0.3 时判为阳性，小于0.2 时判为阴性，若处于0.2~0.3判为可疑；可疑样品需要重复操作进行二次鉴定。