[发明专利]一种CD14真核表达载体的构建及其高表达细胞株的制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种真核表达载体的构建及其利用该载体制备稳定表达细胞株。具体而言，本发明将CD14全长基因克隆至带有荧光蛋白标签的pcDNA3.1-EGFP真核表达载体中，并用构建的真核表达载体转染胃癌SGC-7901细胞，建立CD14稳定过表达的胃癌细胞系。

背景技术

胃癌对人类的健康构成了很大的威胁，胃癌在各类肿瘤引起的死亡中位居第二，又因其同时具有高发性和普遍性的特点所以受到国内外的广泛关注。胃癌的发生是一个复杂的过程，包含着多个因素多个基因的相互作用，其中某些原癌基因的激活以及抑癌基因的失活突变是细胞增殖失控并癌变的主要原因。

随着研究的深入，人们逐渐发现致病菌感染是引起某些基因的异常表达并引发胃癌的根源。幽门螺杆菌(H.pylori)是胃癌及胃黏膜相关淋巴瘤的第一类致癌原，也是危害人类健康的重要病原体之一。Bhasin DK等[Bhasin DK，Kakkar N，Sharma BC et al.Helicobacter pylori in gastric cancer in India.Trop Gactroenterol.1999，20(2)：70-72]发现在接受组织学检查的胃癌患者中有1/3存在着Hp感染。在癌前病变胃粘膜中，Hp感染者的c-met表达明显高于未感染者，且c-met的表达随着病变的进展而增强，表明Hp的感染增加了胃粘膜的损伤程度和敏感性。幽门螺杆菌为微需氧革兰氏染色阴性菌，脂多糖(LPS)是其主要毒性物质，LPS通过与体内多种蛋白的结合而引发一系列的炎性反应。

CD14是富含亮氨酸重复序列的一种糖蛋白，为细菌脂多糖(LPS)的高亲和性受体，主要表达于外周血的单核细胞和组织中的巨噬细胞膜上，可识别革兰氏阴性菌、真菌、结核菌、梅毒螺旋体菌体成分以及与葡萄球菌肠毒素等细菌产物结合，CD14介导机体对LPS的识别及结合，在TLR的配合下将信号传递到细胞内，激活NF-kB进一步诱导一系列细胞因子的表达，引发炎症级联反应。CD14的表达受LPS及其下游炎性细胞因子的调节，并且具有剂量依赖性。另外CD14还可通过细胞内的传导通路引起某些癌基因的活化，对细胞生长、分化、癌细胞产生具有推动作用。

CD14单克隆抗体处理过的单核-巨噬细胞受LPS刺激而被激活的能力明显降低，表明了CD14在宿主细胞中识别LPS及级联反应中的重要作用。近年来，CD14因在病菌感染及介导炎性反应中的重要作用而受到广泛关注。CD14与肿瘤发生发展的关系在国内外已有报道，Tshela等发现CD14高表达的男性中患前列腺癌的风险较高。Martina Seiffert等发现CD14是一种新型的单核细胞衍生的慢性淋巴细胞性白血病细胞的生存因子，由白血病细胞诱导，在体内异常高表达，CD14的rs4914CG基因型多态性与罹患大肠癌高风险性密切相。Christoph L.等推测，CD14的水平可能影响体内TLR辅助调节效应，从而影响某些抗癌疗法或抗病毒反应。

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，Zhao等发现CD14基因-260CT和-260TT多态性会增加胃癌的风险，说明CD14与胃癌发生存在关联。

本发明将CD14全长基因克隆至带有荧光蛋白标签的pcDNA3.1-EGFP真核表达载体中，经双酶切及测序鉴定所构建的pcDNA3.1-EGFP-CD14重组子含有完整及正确的CD14基因。用所述重组质粒转染胃癌SGC-7901细胞，建立CD14稳定过表达的胃癌细胞系。

发明内容

本发明根据GenBank中CD14的mRNA序列(NM_000591)，设计包括整个CD14编码区的上、下游引物，上游引物F1的序列见序列表SEQ NO.1，F1的5’端引入HindIII酶切位点，下游引物R1的序列见SEQ NO.2，R1的5’引入BamHI酶切位点，扩增长度为1153bp。同时设计用于细胞转染后RT-PCR鉴定的CD14片段扩增引物F2其序列见序列表SEQ NO.3，R2序列见序列表SEQ NO.4，内参引物β-actin上游引物F3其序列见序列表SEQ NO.5，下游引物R3的序列见序列表SEQ NO.6。

本发明构建了CD14真核表达载体，通过以下步骤制备：表达CD14的细胞总RNA的提取、CD14编码区的克隆、真核表达载体的构建。

1)表达CD14的细胞总RNA的提取：

a)收集所培养的SGC-7901细胞加入1ml Trizol裂解液，室温下静置5min。