[发明专利]一种CD14真核表达载体的构建及其高表达细胞株的制备

权利要求书

1.一种CD14基因的特异性引物对，其序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

2.CD14真核表达载体制备方法，其通过如下步骤制备，表达CD14的细胞总RNA的提取、CD14编码区的克隆、真核表达载体的构建。

3.根据权利要求2所述的CD14真核表达载体制备方法，其特征在于，所述的表达CD14的细胞总RNA的提取、CD14编码区的克隆、真核表达载体的构建，

具体方法如下：

1)表达CD14的细胞总RNA的提取

a)收集所培养的SGC-7901细胞加入1ml Trizol裂解液，室温下静置5min。

b)加入200μl三氯甲烷，充分混匀，室温放置3min，12000rpm离心10min，取上清。

c)加入500μl异丙醇混匀，室温静置10min，12,000rpm离心10min。

d)弃上清，加1ml75％的乙醇漂洗，7500rpm离心5min。

e)吸取75％的乙醇，于超净台晾干，直到EP管底部的RNA变透明，加入20μl RNase-free ddH₂O，所得即为细胞总RNA。

2)CD14编码区的克隆

a)利用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒，将上一步得到的总RNA进行反转录反应，在200μl反应管中加入总RNA1μg，oligo(dT)1μl，random1μl，dNTP(2.5mM each)2μl，加ddH₂O至14.5μl，混匀后70℃加热5min，冰上冷却2min。瞬时离心后再加入5×First-Strand Buffer 4μl，RNasin0.5μl，TIANScript M-MLV1μl(200U)，总反应体积为20μl，混匀后42℃温浴50min，95℃加热5min终止反应。

b)取1μl反转录产物，加入上述权利要求1所述的引物对各1μl，2×TaqPCR Master Mix10μl，用ddH₂O补足20μl。PCR反应程序为：95℃5min；95℃20s，60℃20s，72℃30s，30个循环；72℃5min结束反应。将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化，得到CD14编码区DNA。

3)CD14真核表达载体的构建

用HindIII和BamHI双酶切pcDNA3.1-EGFP质粒DNA及纯化的CD14编码区DNA，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化目的片段，加入T4DNAligase，16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑取单克隆置于培养基中振荡培养，提取质粒进行酶切鉴定，并将切下目的条带的质粒送测序公司进行测序。

4.一种稳定转染细胞株的方法，包括将权利要求2-3任意一项所述的CD14真核表达载体转染、稳转细胞系的筛选、稳转细胞系中CD14的表达鉴定。