[发明专利]含小檗碱的黄檗愈伤组织培养方法

说明书

所属技术领域：

本发明属于植物组织培养技术的植株再生，以及未分化的人类、动物或植物细胞技术领域，具体涉及到高含量小檗碱的黄檗愈伤组织培养方法。

背景技术：

黄檗（Phellodendron amurense Rupr.）又名关黄柏、黄波罗，为芸香科（Rutaceae）黄柏属（Phellodendron）多年生落叶高大乔木，主要分布在我国的黑龙江、吉林、辽宁、河北等省，具有重要的经济和药用价值。其内皮（韧皮部）入药，称为关黄柏（产于四川等地的黄皮树的内皮则称为川黄柏），是我国传统中药黄柏的重要来源植物之一。黄檗已经被国家列为二级保护植物和重点的植物保护资源，中国植物红皮书将其列为渐危种。传统的黄檗药用方法主要是采取将黄檗立木扒皮，而黄檗的主要药用成分为小檗碱，其在植株中含量低，且黄檗生长缓慢，剥皮严重影响着植株的生长甚至导致死亡，而且消耗大而产出很少，不利于黄檗资源的有效利用。

早在20世纪50年代，人们就发现离体培养的高等植物细胞具有合成并积累植物次生代谢产物的潜力，随着生物技术的发展，用组织培养生产有用的次生代谢产物已成为可能并且取得了相当大的成绩。目前已有80多种药用植物可通过组织培养技术生产其体内含的药用有效成分，有30多种药用植物细胞培养物累积的有效成分等于或高于原植物的含量，如人参皂苷、迷迭香酸等。为了更有效地保护黄檗资源，利用细胞或组织培养生产天然产物药物是开发利用珍贵药用资源的重要途径。

发明内容：

本发明目的在于克服上述利用的不足之处，提供一种含小檗碱较高的黄檗愈伤组织培养方法以及适应该方法所用的培养基。

解决上述技术问题所采用的技术方案是它包括以下步骤：

（1）外植体制备

材料消毒：在超净工作台上将取下的黄檗叶或黄檗茎段在70%的酒精中浸泡15-20秒，再用10％的次氯酸钠消毒8分钟，期间不断摇动，然后用无菌水冲洗3-5次，每次2分钟，用无菌滤纸吸干表面水分；

（2）愈伤组织诱导

将（1）中处理好的黄檗叶片切成0.5×0.5cm²的切块，黄檗茎段切成0.5cm长的切段接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织，该诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：

pH为5.8，配制好的诱导愈伤组织培养基分装在培养瓶中，每瓶25毫升，盖好瓶盖，在压力为0.1～0.15MPa下灭菌30分钟，将培养瓶置于温度为22～26℃、光照强度为40μmol·m^-2·s^-1的培养室中培养，每天光照12～14小时，培养15～20天，待黄檗愈伤组织形成叶后，继续培养30～50天，至黄檗愈伤组织褐化。

本发明培养方法中所用的优选诱导愈伤组织培养基为1升MS培养基中加入下述的原料及其配比制成：

本发明培养方法中所用的最用的最佳诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及配比制成：

本发明培养方法采用喜树叶或茎段为外植体，在MS基本培养基中加入蔗糖、琼脂粉、2，4－二氯苯氧乙酸、6-(苄胺基)嘌呤的培养基中组织培养，得到黄檗愈伤组织。采用本发明组织培养方法以及使用的培养基所培养的褐化黄檗愈伤组织，经高效液相法检测，本发明方法所得到的愈伤组织中小檗碱的含量为5.4%以上，高于现有报道的黄檗枝叶中和黄檗皮中的小檗碱的含量。本发明培养方法以及所采用的培养基，可用于黄檗愈伤组织的培养。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

（1）外植体制备

材料消毒：在超净工作台上将取下的黄檗叶或黄檗茎段在70%的酒精中浸泡15-20秒，再用10％的次氯酸钠消毒8分钟，期间不断摇动，然后用无菌水冲洗3-5次，每次2分钟，用无菌滤纸吸干表面水分；

（2）愈伤组织诱导

将（1）中处理好的黄檗叶片切成0.5×0.5～1.0cm²的切块，黄檗茎段切成0.5～1.0cm长的切段接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织，该诱导愈伤组织培养基为在1升MS基本培养基中加入下述的原料及其配比制成：