[发明专利]烟草基因组分子标记探针与序列集合群及获得方法与应用

说明书

技术领域

 本发明属于生物技术和基因工程技术领域，进一步属于烟草基因研究与应用技术领域，具体涉及一种烟草基因组分子探针与序列集合群及获得方法与应用。

背景技术

烟草（Nicotiana tabacum）属于茄科（Solanaceae）烟草属（Nicotiana），是一年生草本植物。对于植物学科的发展来说，无论是基础研究还是应用研究，烟草作为模式植物都起了很大的作用，如烟草的转基因研究、烟草有益基因分子标记等。尽管我国在烟草种质资源研究方面已做了大量研究工作，但由于受技术手段的限制及烟草各品种间遗传多样性低等原因，至今还未建成一张高密度、覆盖整个基因组的遗传图谱，严重影响了烟草重要农艺性状的遗传基础和遗传规律的研究。目前，在烟草中所应用的分子标记大部分为RAPD标记，尽管该检测技术简便，但重复性较差、可靠性较低且不能鉴别杂合子和纯合子。因此，迫切要求科研人员开发共显性、多态性高、重复稳定性好、简单易用、自动化程度高的新型分子标记技术，对于烟草品种的鉴别有重要意义。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草基因组分子标记探针与序列集合群；另一目的在于提供一种获得烟草基因组分子标记探针与序列集合群的方法；第三目的在于烟草基因组分子标记的探针与序列集合群用于高分辨地鉴别烟草品种。

本发明的第一目的是这样实现的，包括序列表中所列出的№9~№25任一序列的全部或者部分序列。

本发明的另一目的是这样实现的，包括序列群获得、独立序列获得、未知序列筛选、新序列筛选、新序列鉴别，具体包括：

A、序列群获得：搜索和聚集目前公开的烟草基因组原始序列，建立一个烟草基因组序列数据库，以MITE-Hunter软件扫描该数据库，挖掘出；

B、独立序列获得：侯选系列利用MITE二级结构的预测技术，归类MITE候选序列，并去除冗余序列，获得独立的MITE候选序列集合；

C、未知序列筛选；以这些候选MITE序列为模板，同源搜索目前所有的MITE序列数据库，去除已知获已报道的MITE序列，并筛选出未知类型的MITE候选序列；

D、新序列筛选：以TD技术鉴定和分析每一类候选MITE序列在不同烟草品系的拷贝数和多态性，筛选出明确的MITE新序列集合；

E、新序列鉴别：利用筛选完成的MITE新序列集合，分别设计Southern杂交探针、IMP引物和TD引物，以Southern杂交、IMP和TD方法逐一评价以上这些MITE新序列的应用价值，并最终确认一种高分辨各类烟草品种方法的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群。

本发明的第三目在于烟草基因组分子标记的探针与序列集合群应用于下列领域：（1）烟草分子标记辅助育种，也就是烟草新品种的选择和培育；（2）烟草遗传图谱的构建和烟草DNA指纹的鉴别；（3）在烟草基因组中定位重要的功能基因并克隆；（4）烟草重要农艺性状的早期鉴别和筛选；（5）不同烟草品系的亲缘关系鉴别（如在混杂的烟草样品中鉴别其品系构成、烟草栽培品系与其野生种的区分等）；（6）烟草产品的真伪鉴定（如特定品牌的烟草制品其原料构成等）。

MITE是一类广泛分布于动植物基因组中的DNA转座元件，具有以下特征：

（1）其序列长度一般不超过500个核苷酸碱基；

（2）其序列的5’和3’端分别具有末端反向重复（Terminal Inverted Repeat, TIR），并可形成典型的发夹式二级结构，且同一家族成员的TIR序列高度保守；

（3）在其转座到基因组的其他位置时，一般在插入点处产生靶标位点重复(Target Site Duplication ,TSD)的序列结构；

（4）拷贝数较高，并偏好插入到基因组编码区。

Southern杂交是一种进行基因组DNA特定序列定位的重要技术。其原理是利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位转移至尼龙膜等固相支持物上，再与相对应标记探针进行杂交，通过用放射自显影或酶反应显色，检测特定DNA分子的含量及其位置。

IMP是一种利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)来扩增相邻两个MITEs间的序列所具有的长度多态性的分子标记技术。根据MITE的保守TIR区设计引物，利用MITE自身拷贝数高，在基因组中分布均匀的特点，通过特异的几对IMP引物组合即可达到覆盖整个基因组的目的。在水稻、玉米等作物的遗传标记开发中作为一种理想分子标记手段，已用于遗传图谱的构建和标记的辅助育种等研究。