[发明专利]一种对虾MSAP技术分析体系的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于分子标记的建立方法，具体地说，涉及到中国对虾基因组DNA甲基化分析方法，一种对虾MSAP技术分析体系的建立方法。

背景技术

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，是基因组DNA在转录水平上进行调控的一种修饰方式，它参与了基因表达、生长发育和逆境胁迫应答等过程，在基因表达的调控中具有重要作用。对基因组甲基化进行研究最常用的技术是甲基敏感扩增多态性技术（Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP），该方法是利用识别5‘-CCGG序列的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ对基因组DNA甲基化敏感性不同，相同序列可以扩增出不同的谱带，来检测甲基化水平以及有效区分出基因组DNA的甲基化状态。

中国对虾养殖业是我国海水养殖的支柱产业，但自1993年对虾病毒性疾病暴发以来，对虾的病害问题直接影响对虾养殖业的可持续发展，其中主要原因之一是养殖环境的恶化降低了中国对虾的适应性，养殖产量下降。近年来对中国对虾分子生物学方面的研究大多集中在群体遗传结构、遗传多样性及免疫相关功能基因的克隆等方面，与其适应性密切相关的DNA甲基化表观遗传变异尚未见报道。

发明内容

针对相关技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种适用于中国对虾基因组DNA甲基化分析的MSAP技术体系，为研究中国对虾基因组DNA甲基化表观遗传适应机制提供依据，以解决无法通过DNA甲基化来研究中国对虾的适应性的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种对虾MSAP技术分析体系的建立方法，包括如下步骤：（1）首先提取对虾基因组DNA，并稀释备用；（2）建立双酶切反应体系和连接反应体系；（3）建立预扩增反应体系和预扩反应程序；（4）建立选扩反应体系和反应程序；（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染。

其中，步骤（1）中提取的是中国对虾基因组DNA，稀释成200ng/μL，并在-20℃保存待用。

其中，步骤（2）中，双酶切反应体系的总体积为20μL，包括DNA模板200ng， Hpa II或Msp I 7.5U，EcoR I 7.5 U，10×buffer 2μL，加ddH₂O至20μL，37℃ 8h；连接反应体系为25 μL，包括酶切产物5 μL，50pmol的HM接头和5pmol EcoR I接头，2.5U T₄ DNA 连接酶，16℃ 12h。

其中，所述步骤（3）中，预扩反应体系为20μL，包括预扩引物各20pmol，Taq DNA酶 1U， dNTPs 4 pmol，10× Taq buffer (含Mg²⁺33pmol)  2.2 μL，稀释10倍的连接产物 1 μL， 加ddH₂O至20μL； 预扩反应程序：94℃ 30s，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，10个循环，60℃ 30mim，4℃保存备用。

其中，所述步骤（4）中，选扩反应体系为20 μL，包括选扩引物各30pmol，Taq DNA酶 1U， dNTPs 4 pmol，10× Taq buffer (含Mg²⁺30pmol)  2.0μL， 稀释10倍的预扩产物 5 μL，加ddH₂O至20μL；选扩反应程序为：94℃ 30s，94℃ 30s，65℃（每循环降低0.7℃） 30s，72℃ 102min， 10个循环，72℃ 10min，94℃ 30s， 56℃ 30s，72℃ 2min，60℃ 30min，20个循环，4℃保存待用。

其中，所述步骤（5）中，选扩产物与甲酰胺变性上样液以2:1的比例混合，94℃变性5min，冰浴10min，采用65W恒功率进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳2h，银染。甲酰胺变性液的配方在《分子克隆试验指南》中有其详细配置方法。