[发明专利]一种对虾MSAP技术分析体系的建立方法

权利要求书

1.一种对虾MSAP技术分析体系的建立方法，其特征在于包括如下步骤：（1）首先提取对虾基因组DNA，并稀释备用；（2）建立双酶切反应体系和连接反应体系；（3）建立预扩增反应体系和预扩反应程序；（4）建立选扩反应体系和反应程序；（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后获得所需条带。

2.根据权利要求1所述的对虾MSAP技术分析体系的建立方法，其特征在于：所述步骤（1）中提取的是中国对虾基因组DNA，稀释成200ng/μL，并在-20℃保存待用。

3.根据权利要求1所述的对虾MSAP技术分析体系的建立方法，其特征在于：所述步骤（2）中，双酶切反应体系的总体积为20μL，包括DNA模板200ng， HpaII或MspI 7.5U， EcoRI 7.5 U，10×buffer 2μL，加ddH₂O至20μL，37℃ 8h；连接反应体系为25 μL，包括酶切产物5 μL，50pmol的HM接头和5pmol EcoRI接头，2.5U T₄ DNA 连接酶，16℃，12h。

4.根据权利要求1所述的对虾MSAP技术分析体系的建立方法，其特征在于：所述步骤（3）中，预扩增反应体系为20μL，包括预扩引物各20pmol，Taq DNA酶 1U，dNTPs 4 pmol，10× Taq buffer 2.2 μL，稀释10倍的连接产物1μL，加ddH₂O至20μL；预扩反应程序为：94℃ 30s，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，10个循环，60℃ 30min。

5.根据权利要求1所述的对虾MSAP技术分析体系的建立方法，其特征在于：所述步骤（4）中，选扩反应体系为20 μL，包括选扩引物各30pmol，Taq DNA酶 1U， dNTPs 4 pmol，10× Taq buffer (含Mg²⁺30pmol) 2.0μL，稀释10倍的预扩产物5 μL，加ddH₂O至20μL；选扩反应程序为：94℃ 30s，94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 102min， 10个循环，72℃ 10min，94℃ 30s， 56℃ 30s，72℃ 2min，60℃ 30min，20个循环。

6.根据权利要求1所述的对虾MSAP技术分析体系的建立方法，其特征在于：所述步骤（5）中，选扩产物与甲酰胺变性上样液以2:1的比例混合，94℃ 5min，冰浴10min，采用65W恒功率进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳2h，银染。

7.根据权利要求6所述的对虾MSAP技术分析体系的建立方法，其特征在于：所述银染的方法：（1）固定：2L 1%的冰醋酸1h；（2）漂洗：1.5L ddH₂O漂洗两次，每次2min；（3）染色：1.5L银染液，0.5-1h，银染液组成：1.5gAgNO₃+2.25L37％甲醛+315mL10mg/mLNa₂S₂O₃ +1.5LddH₂O；（4）显影：1.5L显影液，3-5min，显影液组成：7.5gNaOH+2.25L 37％甲醛+1.5L ddH₂O；（5）固定：1L ddH₂O 5min。