[发明专利]一种单端孢霉烯B族毒素的合成方法

说明书

技术领域

本发明属于一种单端孢霉烯B族毒素的合成方法，该方法包含三乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素和脱氧血腐镰刀菌烯醇毒素，即3Ac-DON和DON毒素，本发明涉及拟禾谷镰刀菌为菌种，采用自制培养基，通过控制培养条件和固液萃取、液液萃取、柱层析等一系列分离纯化得到一种生物毒素标准品即3Ac-DON毒素，同时用3Ac-DON毒素经碱水解得到DON毒素。

背景技术

3Ac-DON毒素（Ⅰ），化学名为3α-乙酰基,7α,l5-二羟基-l2，l3-环氧单端孢酶-9-烯-8酮和DON毒素（Ⅱ），化学名为(3α,7α),l5-三羟基-l2，l3-环氧单端孢酶-9-烯-8酮，均属于是B型单端孢酶烯族化合物，为一种倍半萜衍生物。3Ac-DON毒素的分子量为338.4g/mol，分子式为C₁₇H₂₂O₇；DON毒素的分子量为296.3g/mol，分子式为C₁₅H₂₀O₆。在我国镰刀菌毒素中DON毒素是镰刀菌毒素中最为常见的一种毒素，在一些欧洲国家，如意大利、法国、西班牙等，禾谷镰刀菌也是玉米属作物中最高发的污染菌种（Logrieco and Bottalico,1988;Bottalico et al.,1989）。人和动物在误食污染谷物或者粮食食品后，会对人体和动物体造成一系列危害如厌食、呕吐、腹泻，严重时危害造血系统。由于DON毒素污染多发于常温，分布广泛，每年给各国经济作物带来严重损失，从70年代开始便备受关注。这类毒素也难以化学合成，目前均采用生物合成的方法来制备毒素。

目前国际上现存的合成路线主要是通过生物发酵来合成DON毒素。生物合成是以产毒的禾谷镰刀菌菌株接种于固体或液体培养基，较为精确控制培养条件，找到最适产毒条件并在此条件下培养产毒的方法。原理是通过人工感染谷物或含有禾谷镰刀菌所需营养成分的液体培养基，培养后进行分离纯化出毒素纯品。然而传统提取工艺流程太过繁琐，仅柱层析多达3步甚至更甚，一些报道的方法如水饱和法重复率低下且分离效果差，且在分离过程中所用试剂毒性大。徐剑宏等人采用液体培养，一定程度上解决了培养过程中产生的色素对分离纯化的干扰，但是其纯度仍然偏低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种单端孢霉烯B族毒素的合成方法，所述的毒素可以作为3Ac-DON和DON毒素对照品，为研究3Ac-DON和DON毒素的毒性、代谢等一系列相关研究提供足够的物质基础，本发明利用尽可能简便的方法来提取获得DON毒素，采用自制大米培养基，提取采用常用有机溶剂并可以重复利用，有效解决传统合成工艺路线长、收率低、成本高、处理繁琐复杂、试剂毒性强、环境污染严重、不易于分离的问题。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明利用发酵法生产DON毒素，其中菌种采用禾谷镰刀菌，经菌种复苏、分生孢子液制备、控制培养温度发酵、萃取、一步柱层析和结晶来生物合成3Ac-DON毒素。具体步骤包括如下：

3Ac-DON毒素制备：

（1）菌种复苏：生产菌种为禾谷镰刀菌Fusarium graminearum DSM No.4528（菌株来源见实施例1），将该菌的菌粉在无菌蒸馏水下室温复水一夜后，接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基（或称复苏培养基PDA，或称PDA培养基），在10-30℃下培养4-10天；

（2）分生孢子液制备：取培养4-10天的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，挑取菌丝至分生孢子培养基，在光照强度为1000lux，15-30℃，200rpm摇床培养3-5天；

（3）大米接种培养：将摇床培养3-5天后的分生孢子液，接种到在121℃高压蒸汽下每次灭菌30分钟，每天一次和灭菌两天后的大米产毒培养基中，接种后置于28℃下黑暗培养7-9天；

（4）3Ac-DON毒素的分离纯化：将步骤（3）的大米产毒培养基用甲醇搅拌浸泡，抽滤回收，滤液减压旋转蒸发至水相浑浊残留，水相残留采用氯化钠饱和；乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相蒸去得棕3Ac-DON粗毒素；用丙酮石油醚洗脱，收集3Ac-DON毒素纯洗脱液，蒸去洗脱液得到白色固体，乙酸乙酯溶解后冷却结晶；