[发明专利]一种猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物传染病检测用试剂盒，属于兽用生物制品领域。

背景技术

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是引起猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumoniae of swine，Mps又称猪气喘病）的主要病原，也是猪呼吸道疾病综合症的一种重要的原发性病原。Mhp主要感染猪呼吸道，本身致病力不强，临床症状主要以咳嗽和气喘为主，病变特征主要是肺的尖叶、心叶、中间叶和隔叶前缘呈“肉样”或“虾肉样”实变。Mhp感染机体后主要与呼吸道内壁的纤毛黏附，引起纤毛细胞病变和凋亡，导致纤毛断裂和脱落，引起机体发病，并且会严重影响猪的生长发育和饲料转化率，或者破坏粘膜-纤毛屏障，容易继发其他致病菌的感染（特别是对青年猪），提高致死率，因而给养猪业造成巨大的经济损失。目前猪支原体肺炎的主要防治措施是疫苗和药物，但由于缺乏有效的药物，且疫苗免疫后仅能减轻患猪临床症状的发生，降低死亡率，不能抵御机体对Mhp强毒的感染。因此，建立一种敏感、稳定的检测方法对本病的检测和监控及流行病学调查具有重要的意义。

目前，猪肺炎支原体的诊断技术主要有以下四种：临床检查、细菌学检查、分子生物学检查和血清学检查。支原体体外培养比较复杂，Mhp的分离培养具有一定的难度，并且时间较长，容易漏检，不适合于临床应用。已有研究报道，通过PCR扩增特异性片段的方法来检测，具有较好的效果，但通过呼吸道采集样品，势必会对猪只造成不同程度的影响，且PCR法有一定的技术要求，仪器设备要求较高，价格昂贵，不易于在生产实际中推广应用。血清学检测则可避免以上缺点。国内外建立了多种血清学检测方法如免疫琼扩、间接血凝等，免疫琼扩、间接血凝试验虽操作简单，但存在敏感性不高的问题。ELISA方法操作简单，敏感性高，特异性好，可作为检测的有效手段，并可在基层得到广泛应用。目前，国内外均有相关研究报道，国外虽已研制成了ELISA检测试剂盒，但检出率低，且价格较为昂贵。因此，建立一种适用的、特异性好的、稳定性高的Mhp ELISA检测手段是目前有效控制该病发生的关键。

本病全球性分布，国外远领先于国内。Mhp与其他支原体之间存在严重的交叉反应，从而给Mhp的鉴别诊断带来了困难。目前，关于Mhp诊断方法，国内报道甚少，而国外研究较多。常用的ELISA方法，但由于交叉反应等影响，未能达到理想的效果。通过研究Mhp中特异性蛋白而建立诊断方法是目前研究的焦点。由于Mhp缺乏细胞壁，所以菌体的主要抗原物质存在于荚膜和细胞膜。荚膜中含有多种粘附蛋白和粘附相关蛋白等膜分子；细胞膜成分的2/3为蛋白质，分布于细胞膜的内外层，1/3为脂类，分布于细胞膜的中层。猪肺炎支原体的抗原组成成分主要是蛋白质与脂质两类。脂质包括糖脂和脂多糖，它们都是半抗原，与蛋白质结合后具有抗原性。

国内外学者已对猪肺炎支原体多种抗原蛋白进行了研究，其中包括乳糖脱氢酶P36蛋白、膜蛋白P46、热休克蛋白DnaK以及黏附素蛋白P97。这些蛋白均特异性好，且分别是猪肺炎支原体感染早中晚期诱导产生抗体的蛋白之一，是已知抗原蛋白中用于检测用抗原较为理想的蛋白。体外表达蛋白经镍柱亲合层析纯化后作为抗原，建立间接ELISA检测方法，并优化ELISA的反应条件形成检测试剂盒，该试剂盒具有高特异性，高稳定性。试剂盒主要供实验室研究和临床诊断使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，为实验室和临床检测猪肺炎支原体抗体提供快速、准确、简便的检测工具。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，试剂盒中设有：多重组抗原包被的ELISA板，酶结合物工作液，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，二抗稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液；其中所述的多重组抗原为猪肺炎支原体蛋白P36、猪肺炎支原体蛋白P46、猪肺炎支原体蛋白P97R1和猪肺炎支原体蛋白DnaK。

其中，本发明所述的猪肺炎支原体蛋白P36、P46、P97R1和DnaK按如下方法获得：

1、猪肺炎支原体蛋白P36按专利ZL200910027160.4的方法获得。

2、猪肺炎支原体蛋白P46按文献【猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达，江苏农业学报，2008,24(3):288-292】的方法获得。

3、猪肺炎支原体蛋白P97R1按专利ZL200910027159.1的方法获得。