[发明专利]一种猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒

权利要求书

1.一种猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中设有：多重组抗原包被的ELISA板，酶结合物工作液，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，二抗稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液；其中所述的多重组抗原为猪肺炎支原体蛋白P36、猪肺炎支原体蛋白P46、猪肺炎支原体蛋白P97R1和猪肺炎支原体蛋白DnaK。

2.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的多重组抗原包被的ELISA板按如下方法制备得到：使用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将猪肺炎支原体蛋白P36、P46、P97R1和DnaK作为抗原分别以0.5-2μg/ml、5-10μg/ml、5-10μg/ml和5-10μg/ml的包被浓度等体积混合，进行包板，每个样孔100μL混合抗原，置湿盒，37℃孵育1h，4℃过夜，甩干包被液，用PBST洗涤3次，3-5min/次，加入封闭液10g/L酪蛋白PBS，200μl/孔，置湿盒，37℃孵育1h，甩干，加50g/L蔗糖水溶液37℃孵育1h，甩干后抽空封装，置2-8℃保存。

3.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体。

4.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照血清为猪肺炎支原体间接血凝和IDEXX公司的ELISA检测试剂盒检测为阳性的猪血清；所述的阴性对照血清为猪肺炎支原体间接血凝和IDEXX公司的ELISA检测试剂盒检测为阴性的猪血清。

5.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液和二抗稀释液均按如下方法制备得到：氯化钠8.0g，KH₂PO₄ 0.3g，Na₂HPO₄.12H₂O 5.33g，KCl 0.2g加ddH₂O至900ml，加入10g酪蛋白后充分溶解后，调整pH至7.2-7.4，加入0.5mL Tween-20和0.1-0.5g硫柳汞，加ddH₂O定容至1000mL。

6.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的10×浓缩洗涤液为10×PBST，即含有5mL/L Tween-20和0.1-0.5g/L硫柳汞的10×PBS。

7.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的显色液A按如下方法配制：Na₂HPO₄ 14.6g，柠檬酸9.33g，过氧化氢脲0.52g，加ddH₂O至1000ml，调至pH5.0～5.4；所述的显色液B按如下方法配制：TMB200mg，无水乙醇100ml，加ddH₂O定容至1000ml；显色液A与B按如下方法配制工作液：底物液A与B液1:1(V:V)混合使用，混匀。

8.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。