[发明专利]用于检测抗草甘膦转基因大豆转化体特异性序列的引物组、试剂盒及方法

权利要求书

1.抗草甘膦转基因大豆及其加工品的检测引物组，包括引物组1和引物组2，其中，引物组1包括外引物Lectin-F3、Lectin-B3和内引物Lectin-FIP、Lectin-BIP，序列如下：

Lectin- F3 GCCGAAGCAACCAAACATG（SEQ ID NO:1）；

Lectin-B3 GGGGCATAGAAGGTGAAGTT（SEQ ID NO:2）；

Lectin-FIP TGGGGTGCCGTTTTCGTCAACATCCTCCAAGGAGACGCTAT（SEQ ID NO:3）；

Lectin-BIP ACCCTCGTCTCTTGGTCGCG-GGCAACGCTACCGGTTTC（SEQ ID NO:4）；

引物组2包括外引物RR-F3、RR-B3和内引物RR-FIP、RR-BIP，序列如下：

RR-F3 ATAGGGAACCCAAATGGAA（SEQ ID NO:5）；

RR-B3 TTGTGCGTCATCCCTTAC（SEQ ID NO:6）；

RR-FIP GGCATCTTGAACGATAGCCTTTCAAGGAAGGTGGCTCCTAC（SEQ ID NO:7）；

RR-BIP CACGAGGAGCATCGTGGAAATCAGTGGAGATATCACATCAA（SEQ ID NO:8）。

2.抗草甘膦转基因大豆及其加工品的检测试剂盒，包括：（1）权利要求1所述的引物组1；（2）权利要求1所述的引物组2；（3）Bst DNA聚合酶；（4）LAMP反应液；（5）染色剂；（6）内对照；（7）阳性对照。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物组1中外引物和内引物的添加摩尔比为1:8；所述引物组2中外引物和内引物的添加摩尔比为1:8。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的LAMP反应液，由0. 2 mol/L Mg₂SO₄ 、25 mmol/L dNTP、10×Bst buffer、5 mol/L 甜菜碱按1：4：10：20的比例配比而成。

5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述染色剂为SYBR Green。

6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的内对照为含有大豆内参照基因Lectin（SEQ ID NO:9）的重组质粒；所述阳性对照为含有抗草甘膦转基因大豆转化体特异性序列（SEQ ID NO:10）的重组质粒。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，内对照和阳性对照的重组质粒所用的载体为pMDl8-T载体。

8.利用权利要求2的试剂盒检测抗草甘膦转基因大豆及其加工品的方法，包括如下步骤：

（1）提取纯化待检样品DNA；

（2）LAMP法检测；

LAMP法检测Lectin基因：设置样品管（加样品DNA）、内对照（加含有Lectin基因的重组质粒DNA）、空白对照（加灭菌去离子水）， 25μL反应体系含有 ：引物组1外引物对0.2μmol/L，内引物对1.6μmol/L，Bst DNA聚合酶0.32U/μL，LAMP反应液9μL，待检样品DNA50ng，用灭菌去离子水补齐到25μl；将配制好的反应管混匀后离心，并于65℃反应50min，并在80℃持续10min；反应完毕后，往反应管中加入染色剂，混匀，根据显色结果来判断待检样品中是否含有Lectin基因；

LAMP法检测抗草甘膦转基因大豆转化体特异性序列：设置样品管（样品DNA）、阳性对照（含有抗草甘膦转基因大豆转化体特异性序列的重组质粒DNA）、空白对照（灭菌去离子水）， 25μL反应体系含有：引物组2外引物对0.2μmol/L，内引物对1.6μmol/L ，Bst DNA聚合酶0.32U/μL，反应液9μL，待检样品DNA50ng，用灭菌去离子水补齐到25μl；将配制好的反应管混匀后离心，并于65℃反应50min，并在80℃持续10min；反应结束后，往反应管中加入染色剂，混匀，根据显色结果来判断待检样品中是否含有抗草甘膦转基因大豆转化体特异性序列；

（3）结果判断：如果步骤（2）中内对照、阳性对照呈阳性，空白对照呈阴性，而样品Lectin基因检测呈阳性、抗草甘膦转基因大豆转化体特异性序列检测呈阳性，则表明待检样品含有抗草甘膦转基因大豆成分。