[发明专利]一种基质表达T.fusca角质酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基质表达T.fusca角质酶的方法，属于生物工程技术和酶工程领域。

背景技术

角质酶是一种多功能酯酶，既可催化水解不溶性多聚物角质和各种聚酯的酯键，也可以作用于其它长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯等。除了水解反应外，角质酶还能催化酸与醇的酯化、一些脂肪酸盐与醇的转酯化。因此角质酶在食品工业、化工工业及纺织工业等诸多领域均有广泛用途。

目前研究者对真菌角质酶中的Fusarium solani角质酶进行了深入的研究，包括晶体结构解析、分子改造和高效表达等各个方面。其中关于制备研究尚处在实验室阶段，主要集中于野生菌的培养条件优化以及在不同的基因工程宿主细胞(如酵母、大肠杆菌、曲霉属和镰刀菌属)中进行高效表达、优化生产工艺等方面的研究，但由于存在基因工程异源表达时表达量较低和稳定性较差的问题，并且生产成本较高，至今为止没有实现工业化生产，同时真菌角质酶本身存在热稳定性差的缺点，不能适合纺织工业的高温处理环境。

与真菌角质酶相比，细菌角质酶具有催化效率高、环境适应能力强、基因工程异源表达技术成熟等方面的优势。但是迄今为止国内外关于细菌角质酶的报道很少，仅有的报道集中在产角质酶菌种的筛选、发酵条件优化和粗酶性质研究等方面。本课题组前期工作中鉴定了嗜热放线菌Thermobifida fusca角质酶的基因，通过酶学定性和应用效能评价表明其非常适合纺织工业应用。采用大肠杆菌外源重组蛋白分泌表达中应用最普遍的I型和II型分泌途径进行了T.fusca角质酶的克隆表达和高效分泌研究，其中I型途径经过发酵条件优化，在3L发酵罐上胞外产量达到700-750U/mL，生产强度约为22.6U/mL/h，为目前角质酶生产中的最高水平。

前期工作中还发现T.fusca角质酶具有磷脂酶的水解活性，本发明将成熟的角质酶基因在大肠杆菌中克隆表达，通过角质酶对细胞膜磷脂的有限水解作用使细胞膜通透性增强，进而使得角质酶释放至培养基中，实现基质表达。

发明内容

本发明提供了一种基质表达T.fusca角质酶的方法，其特征在于，将NCBI编号为AAZ54921的T.fusca角质酶成熟蛋白基因在大肠杆菌中诱导表达，诱导培养并收集发酵上清液。

为解决上述技术问题，具体方法为：

1)由本研究室前期构建的Tfu_0883/pET-20b(+)为模板，PCR扩增得到角质酶成熟蛋白基因，连接表达载体，得到重组质粒Tfu_0883/pET20b(+)^NS；

2)含有重组质粒Tfu_0883/pET20b(+)^NS导入宿主大肠杆菌，构建生产角质酶的基因工程菌；

3)步骤2)构建的重组大肠杆菌经诱导培养，收集发酵上清液。

所述宿主菌可以为：E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110、E.coli JM109、E.coli JM109(DE3)、E.coli DH5α等，其中优选E.coli BL21(DE3)。

所述携带角质酶和目标蛋白的载体为pUC系列，pET系列，pT7-7，pGEX等任意一种。

附图说明

图1重组大肠杆菌摇瓶发酵生产角质酶的过程曲线图

■，DCW；□，培养基中角质酶酶活

图2重组大肠杆菌生产角质酶的SDS-PAGE分析

1，蛋白质分子量标准；2，发酵液上清；3，细胞破壁上清；4，细胞破壁沉淀图3重组大肠杆菌3L发酵罐生产角质酶过程曲线图

■，DCW；□，培养基中角质酶酶活

具体实施方式

实施例1：重组质粒的构建

根据T.fusca角质酶成熟蛋白基因(NCBI编号：AAZ54921)，设计引物P1，P2。

P1：5’-gTAATCCATATggCCAACCCCTACgAgCgC-3’含有NdeI酶切位点

P2：5’-AgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’含有EcoRI酶切位点