[发明专利]金核霉素的生物合成基因簇及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域。具体地说，本发明涉及金核霉素的生物合成基因簇及其应用。

背景技术

金核霉素(aureonuclemycin)是1987年从金色链霉菌苏州变种(Streptomyces aureus var.suzhoueusis n.var Yen et al，中国微生物菌种保藏管理委员会编号CGMCCNo.0122；中国专利申请CN87100250)的发酵产物中分离得到的。作为一种优质的农用抗生素，金核霉素得到了广泛的应用。

金核霉素及其结构类似物的化学合成已经由Nicholas J.Newcombe与Satoshi Ichikawa等人作过深入研究，经过一个核心的由SmI₂催化的Aldol反应形成C-糖苷键，实现金核霉素骨架结构的形成，然后经过多步反应实现环化和立体结构控制，生成终产物。化学合成经历的步骤繁琐，试剂复杂昂贵，并且合成过程中立体控制困难。Satoshi Ichikawa等人合成herbicidinB过程中，开始得到的产物并不是目标产物herbicidinB，而是它的异构体，他们经过分析后，改变了策略才成功的得到了herbicidinB，但是产量很低，不能做为工农业生产用途。

上海市农药研究所，经过二十年的努力，通过“试差法”，改变、调整发酵参数，摸索出了适合金核霉素生产的发酵条件，使金核霉素的产量得到了很大提高。但是仍然满足不了农业应用方面对金核霉素大量且质优价廉的要求；通过对其发酵液的HPLC检测，发现在发酵条件下，发酵液中除了金核霉素作为主要产物外，还有一种占很大比例的副产物5-脱氧次黄嘌呤核苷，将它的结构与金核霉素对比，发现其骨架结构与金核霉素具有很大的相似性，而且由于该副产物总是伴随着金核霉素的产生而产生。然而，迄今为止本领域尚未揭示金核霉素合成基因簇。

因此，本领域急需了解金核霉素生物合成相关的基因或基因簇，以便研究金核霉素的生物合成途径，进而通过基因工程和代谢工程手段提高金核霉素产量。

发明内容

本发明的目的就是提供涉及金核霉素的生物合成基因簇，及其克隆、功能研究和应用。

在第一方面，本发明提供一种金核霉素生物合成基因的集合，所述基因集合由编码AnmB蛋白的基因、编码AnmC蛋白的基因、编码AnmD蛋白的基因、和编码AnmE蛋白的基因构成。

在一优选例中，所述的AnmB蛋白包括选自下组的多肽：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽；或

(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；

所述的AnmC蛋白包括选自下组的多肽：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的多肽；或

(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；

所述的AnmD蛋白包括选自下组的多肽：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的多肽；或

(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；和

所述的AnmE蛋白包括选自下组的多肽：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的多肽；或

(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在第二方面，本发明提供一种金核霉素生物合成基因簇，所述基因簇包括金核霉素生物合成涉及的4个基因，所述基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-10434位碱基所示，具体为：

1)基因anmB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-6964位碱基所示，编码的蛋白为腺苷高半胱氨酸水解酶，长度为556个氨基酸；