[发明专利]用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取基因组DNA的方法，尤其是一种用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法。

背景技术

在分子生物学、转基因材料检测等研究中, 高质量基因组DNA的获得是重要前提，获取DNA质量的优劣可能直接影响到后期试验研究的成败，因此提取基因组DNA的方法是生物技术中一项重要技术手段。植物材料由于不同物种之间其生理生化特点不同，不同生长期、不同生长部位及生长在不同条件下其内含物也不一样，其DNA提取的难易不同，提取的方法也不尽相同。目前国内外研究并使用的DNA提取的方法有很多，其中被最广泛应用的是传统的CTAB即十六烷基三甲基溴化铵法和SDS即十二烷基磺酸钠法；水稻、小麦、棉花等一年生作物，一般采用SDS法和改良SDS法，就可得到高质量的基因组DNA；而多年生的木本果树，由于富含多糖、酚类或单宁等物质，一般多采用CTAB法或改良CTAB法，因为CTAB既可以裂解细胞，又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀；但对不同树种，CTAB法提取基因组DNA的效果不同，为了得到理想的DNA提取效果，针对不同树种、不同材料的具体特点，现有提取基因组DNA的方法大都在CTAB基础上进行一些适当的调整。对田间生长的梨树提取基因组DNA的方法，大多是在CTAB法的基础上进行不同的调整，即添加抗氧化剂防止材料褐变，其方法主要有：一是在磨样时添加Vc；二是在磨样时或在提取液中添加PVP或在提取液中同时加Vc和PVP，都得到了理想的结果；但上述提取基因组DNA的方法中其样品材料都取自田间生长的植株，而对于生长在试管内的无菌苗，由于生长环境的不同，其材料的内含物也不同，应用上述的ＤＮＡ提取方法去提取梨树试管苗的DNA，结果得到的是很难溶解的黏稠的胶状物,　经琼脂糖凝胶电泳检测，观察不到DNA条带的出现；说明添加抗氧化剂的CTAB改良方法不适用于梨树试管苗材料基因组DNA的提取。目前还没有一种用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法。

发明内容

为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法，获得高质量的基因组DNA。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：其步骤是：

（1）、把研磨至粉末状的试管树苗进行预前处理，预前处理步骤为：a、把增殖生长30-40天的试管树苗顶部嫩梢，研磨至粉末转入离心管中，按照试管树苗与提取液体积与β－巯基乙醇的比例1 g : 3-10 ml : 25-80 ul ，依次加入提取液和β－巯基乙醇，摇动混合均匀；在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中把离心管运行8-12分钟；b、丢弃上清部分，加入提取液溶解沉淀，在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中把离心管运行8-12分钟；C、至少重复步骤b两次，在离心管中得到的沉淀物即为经过预前处理的前期试样；

（2）、使用高盐CTAB提取液按照CTAB方法，得到试管树苗进行提取基因组DNA的后期试样。

裂解细胞膜前用提取液对研磨好的样品重复洗涤３次，并加入0.2-2%　β－巯基乙醇，目的是去除多糖。β－巯基乙醇防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除，用含高盐（4-6 M NaCl）的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液去除残留的多糖。CTAB可裂解细胞膜、核膜，使DNA从细胞中释放出来。由于设计了预前处理步骤和用高盐CTAB提取液作为介质的CTAB方法，把试管树苗中的蛋白质和多糖充分处理，使ＤＮＡ释放出来，因此制取基因组DNA效果好。

 

本发明设计了，提取液设置为包含有100 -120 mM pH值为 8的Tris-HCl、 4-6 mM pH值为 8的EDTA、0.35-0.5 M 山梨醇、0.2-2 % w/vβ－巯基乙醇。

本发明设计了，高盐CTAB提取液设置为包含有40-60 mM pH值为 8的Tris-HCl、4-6 M pH值为 8的NaCl、25-30 mM pH值为 8的EDTA、 1.5-2.5 %w/v CTAB、1-2% w/vPVP、8-12%w/v 十二烷酰基肌氨酸钠。

本发明设计了，其步骤为：

1、 取0.1- 0.3 g增殖生长30-40天的试管树苗顶部嫩梢，放入直径为５cm的小研钵中，加入液氮用研杵快速研磨至粉末，加入0.8-1.0 ml提取液，转移到1.5 ml 离心管中，置于冰上存放，再去研磨第二个样品；所有样品准备好后，在通风厨内向每一离心管内加入8-10 ul β－巯基乙醇，摇动混合均匀。