[发明专利]用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法

权利要求书

1.一种用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法；其特征是：其步骤是：（1）、把研磨至粉末状的试管树苗进行预前处理，预前处理步骤为：a、把增殖生长30-40天的试管树苗顶部嫩梢，研磨至粉末加入离心管中，按照试管树苗与提取液体积与β－巯基乙醇的比例1 g : 3-10 ml : 25-80 ul，依次加入提取液和β－巯基乙醇，摇动混合均匀；在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中把离心管运行8-12分钟；b、抛弃上清部分，沉淀再次加入提取液，上下颠倒离心管使沉淀充分溶解，在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中把离心管运行8-12分钟；C、至少重复步骤b两次，在离心管中得到的沉淀物即为经过预前处理的前期试样，（2）、使用高盐CTAB提取液按照CTAB方法，得到试管树苗进行提取基因组DNA的后期试样。

2.根据权利要求1所述的用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法；其特征是提取液设置为包含有100-120mM pH值为 8的Tris-HCl、 4-6mM pH值为 8的EDTA、0.35-0.5 M 山梨醇、0.2-2%w/vβ－巯基乙醇。

3.根据权利要求1所述的用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法；其特征是：高盐CTAB提取液设置为包含有40-60 mM pH值为 8的Tris-HCl、4-6 M pH值为 8的NaCl、25-30 mM pH值为 8的EDTA、 1.5-2.5 % w/v CTAB、1-2%w/vPVP、8-12%w/v十二烷酰基肌氨酸钠。

4.根据权利要求1所述的用于提取试管树苗的基因组DNA的试样制备方法；其特征是：其步骤为：

（1）、 称取0.1-0.3 g增殖生长30-40天的试管树苗顶部嫩梢，放入直径为５cm的小研钵中，加入液氮用研杵快速研磨至粉末，加入0.8-1.0 ml提取液，转移到1.5 ml 离心管中，置于冰上存放，再去研磨第二个样品；所有样品准备好后，在通风厨内向每一离心管内加入8-10 ul β－巯基乙醇，摇动混合均匀；

（2）、在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟；

（3）、丢弃上清部分，加入提取液，充分溶解沉淀，重复第2步骤；

（4）、重复第3步骤；

（5）、在每个离心管中，加入450-550 ul 提取液使沉淀充分溶解，然后再加入300-400 ul 高盐CTAB提取液，混匀后，置于温度为６５℃水浴中孵育45-90分钟；期间摇动几次离心管，即每个离心管为试样Ⅰ；

（6）、 在每个含有试样Ⅰ的离心管中加入等体积氯仿，颠倒混合均匀，在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟；

（7）、吸取上清物到另一个离心管，再加入等体积氯仿，重复第6步骤；

（8）、吸取上清物到一新的离心管，加入２倍体积的100%的乙醇和1/10体积的3M NaAC, 颠倒混匀，在温度为-18－-22℃的环境中，放置30分钟或过夜；

（9）、在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟；

（10）、丢弃上清部分，沉淀用70%-75%乙醇洗涤2-3次,　然后放到超净工作台上，无菌风吹干，每个离心管内的沉淀为试样Ⅱ；

（11）、在每个含有试样Ⅱ的离心管中加50-100 ul的电导率为３左右的纯净水溶解沉淀，再加入0.5-1.0 ul RNAase A, 置于温度为37℃水浴中孵育30-60分钟；

（12）、加入等体积氯仿，轻轻颠倒混合均匀，在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟；

（13）、 吸取上清物到另一个新离心管，再加入等体积氯仿，重复第12步骤；

（14）、吸取上清物到另一个离心管，加入２倍体积的100%乙醇和1/10体积的3M NaAC, 上下颠倒混合均匀，在温度为-18－-22℃的环境中，放置至少2小时；

（15）、在温度为3-6℃的环境中，在离心力为8000-12000 g的离心机中运行8-12分钟；

（16）、丢弃上清部分，沉淀用70%-75%乙醇洗涤1-2次,　再放到超净工作台上，无菌风吹干，得到的沉淀即为试样Ⅲ；

（17）、把纯净水加入到试样Ⅲ中，放到温度为-18－-22℃冰箱中保存备用。