[发明专利]一种简便快速检测绵羊多胎基因BMPR-IB的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其适用于从绵羊羊毛毛囊中简便快速提取基因组DNA，继而用于检测绵羊BMPR-I B多胎基因A746G位点的试剂盒及方法。

背景技术

Fec^B基因是在绵羊中识别出的高繁殖力的第一个主效基因，后被证明该基因实际为BMPR-IB基因，现已发现在澳大利亚Booroola Merino绵羊、印度Garole绵羊、印度尼西亚Javanese绵羊、中国的湖羊、小尾寒羊、中国美利奴羊（军垦型）、中国美利奴羊（新疆型）、滩羊、策勒黑羊中存在BMPR-IB基因A746G突变位点，该基因对绵羊的排卵数与产羔数有显著影响，是控制绵羊产羔数的主效基因之一。

文献检索披露：①2010年11月由新疆农垦科学院的管峰等申请了专利“一种快速检测绵羊多胎Fec^B基因的方法”,该发明所提供的利用四条单链扩增引物进行Fec^B基因分型的方法，是由特异性上游引物F1、下游引物R1和对照上游引物F2、下游引物R2共同对待测绵羊基因组DNA扩增，然后对PCR扩增产物进行电泳分析，确定序列扩增产物中条带大小和数目，产物有三种情况：包含220bp和120bp；220bp和160bp；220bp、160bp和120bp。②2011年5月，新疆农垦科学院的杨华等申请了专利“绵羊BMPR-IB基因A746G多态性检测试剂盒及检测方法”，公开的绵羊BMPR-IB基因A746G多态性检测试剂盒，主要包含扩增液、至少1张基因芯片、杂交缓冲液I和II、预杂交液、Taq酶、杂交显色试剂；另外公开了利用该试剂盒进行检测的方法步骤：制备多个绵羊的染色体DNA备用；试剂盒组装；用PCR方法扩增；变性处理；预杂交及杂交；杂交信号检测。

目前，关于检测BMPR-IB基因A746G突变位点的试剂盒及方法的相关发明较少，针对BMPR-IB基因检测的发明及方法，获取DNA的手段基本上都是通过酚仿抽提法提取试验动物血液中的DNA来实现的，但常规的酚仿抽提法操作过程较为繁琐，需要用蛋白酶K进行较长时间的消化，在多步操作中会有基因组DNA损失，整个检测过程较长，且所用酚仿等试剂对操作者身体健康不利。

高质量基因组DNA的提取是后续分子生物学研究的重要基础，较容易获得而且最常用的材料有动物的血液、耳组织、尾组织或趾尖等样品，采集这些组织虽不至于导致动物死亡，但对动物均会或多或少地造成身体伤害，易产生应激，尤其是对于经济价值高或濒临灭绝的珍稀保护动物更不适用，提取动物毛发则相对简便，并且对动物几乎不会造成伤害，另外，毛发更便于长期保存和长途运输，不需要冷藏，也不需要特殊处理。

文献关于从毛发中提取DNA的方法也有报道：⑴余舰等在蛋白酶K(56℃)作用下，采用酚-氯仿反复抽提法从毛发中提取了微量的DNA，但缺点是提取的DNA的量较少。⑵徐艳春等和伍新尧等用Chelex-100处理毛发制备DNA，达到1根毛发提取得到的DNA即可得到较好的实验结果，但用此方法对毛囊细胞裂解不够彻底，残留的消化液对后继的PCR过程有一定的影响。而后，⑶李军林等在常规的酚-氯仿提取法的基础上加以优化，以pH8.8Tris-HCl、MgCl₂溶液和蛋白酶K为裂解液消化，使其获得了较高质量的DNA，但操作繁复、耗时。(4)赵春江等在此基础上加以改进，以常用的PCR缓冲液、MgCl₂溶液和蛋白酶K为裂解液，在PCR仪上设置一个单循环程序：65℃30min，95℃15min，4℃10min，而后瞬时离心PCR管，上清液即可做PCR模板，此法采用的较高消化温度(65℃)，可使蛋白酶K在较短时间内高效地消化毛囊中的蛋白质，使细胞释出DNA；PCR的缓冲液中含有的Tris碱和PCR缓冲液的pH值，可在DNA提取过程中起到保护DNA、防止降解的作用；在PCR仪上，95℃15min过程可使蛋白酶K灭活，防止蛋白酶K在后续PCR过程中消化Taq酶而使PCR扩增无法进行，该方法可以用于大量标本的处理，且效果较好，但该方法中所用试剂价格相对较高且需保存在-20℃条件下。⑸杨胜林等通过从不同数量的猪毛中提取的DNA进行质量比较分析，找出了适合于做分子标记试验所需的猪毛样本数量，Di Martino等采用剪除毛干、保留毛囊的方法预处理毛发，可以减少角蛋白污染，提高DNA提取物的浓度和纯度。

本发明的试剂盒，适用于检测绵羊BMPR-IB多胎基因A746G位点，可在24小时内准确得出检测结果，为绵羊早期选种，即快速检测绵羊多胎基因，提供了一种效率高、操作简便和经济实用的可规模化实施的检测方法。

发明内容