[发明专利]一种简便快速检测绵羊多胎基因BMPR-IB的试剂盒

权利要求书

1.一种简便快速检测绵羊多胎基因BMPR-IB的试剂盒，其特征在于：利用试剂盒从羊毛毛囊中快速提取基因组DNA，并运用PCR-RFLP技术检测BMPR-IB多胎基因A746G位点；

其中试剂盒包括：毛样DNA提取液A和B，PCR扩增液、限制性内切酶Ava II、10×Buffer R、染料、ddH₂O、说明书；

（1）毛样DNA提取液A为175mM的NaOH溶液；

（2）毛样DNA提取液B为175mM的HCl 16.7μl，100mM的Tris-HCl、pH8.5、500μl，ddH₂O 483.3μl；

（3）PCR扩增液为2×Taq PCR MasterMix10.0μl，ddH₂O 7.7μl，10mM的上下游引物各0.4μl，BMPR-IB基因的上下游引物由上海生物工程技术有限责任公司合成；上游引物序列：5'GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG3'；下游引物序列：5'CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC3'；

（4）限制性内切酶Ava II为10U/μl；

（5）10×Buffer R为100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂，1M KCl，1mg/mlBSA；

（6）染料为6×RNA/DNA Loading buffer；

（7）ddH₂O；

（8）说明书；

其中对绵羊繁殖力基因的检测：

（1）毛样DNA的提取：取15-30根带有毛囊的毛样，用70％乙醇清洗2次，蒸馏水清洗2次，用消毒剪，剪切0.4cm根部毛样，放入0.2ml离心管中离心，3500rpm、5-10s；加15μl毛样DNA提取液A，漩涡混合离心，3500r pm、5-10s；用热循环程序实施热循环：75℃1min，80℃ 2min，85℃ 1min，95℃1min，97℃ 5min；从热循环仪上取下，加入15μl毛样DNA提取液B，漩涡混合，-20℃保存；经3500rpm、5-10s离心，取上清作为DNA模板，PCR扩增备用；

（2）PCR扩增：将1.5μl DNA模板加入对应标号的PCR管中，再加入18.5μl PCR扩增液，弹去气泡，震荡混匀，经3500rpm、5-10s离心；放入设定好程序的PCR仪中，反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s、60℃退火温度30s、72℃延伸30s共30个循环，72℃延伸5min，4℃保存；用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测，电压120V、电泳30min、EB染色，凝胶成像扩增产物符合预期片段140bp；

（3）PCR-RFLP检测：酶切反应体系为ddH₂O2.5μl，10×Buffer R2.0μl，限制性内切酶Ava II 0.5μl，PCR扩增产物5.0μl；放入37℃恒温箱消化4h；用2.5%的琼脂糖凝胶电泳进行酶切产物检测，电压120V、电泳30min、EB染色，凝胶成像系统成像，其基因判型结果：看不到30bp条带，只见140bp、110bp条带。

2.按照权利1所述的方法，其特征在于：所用三羟甲基氨基甲烷，即Tris-base，由庄盟生物提供；2×Taq PCR MasterMix由博迈德生物提供；限制性内切酶Ava II、10×Buffer R由MBI Fermentas公司提供；6×RNA/DNA Loadingbuffer由博迈德生物提供；ddH₂O由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供；DL2000DNA Marker由庄盟生物提供；EB由天根生化科技有限公司提供；3-18K高速冷冻离心机产自SIGMA公司；JY04S凝胶成像仪产自北京君意东方电泳设备有限公司。