[发明专利]前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及光激发偶联免疫检测技术，具体是一种前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

1971年，Hara等人首先发现前列腺特异抗原( prostate specific antigen , PSA)，它由前列腺上皮细胞合成并分泌至精液中，是精浆的主要成分之一。前列腺特异抗原具有器官特异性，仅存在于前列腺上皮细胞、导管上皮细胞的胞质和黏液内，具有糜蛋白酶样和胰蛋白酶的活性。正常情况下，前列腺腺泡与淋巴系统之间存在由内皮层、基细胞层和基底膜构成的屏障相隔，外周血中不会出现前列腺特异抗原。当发生肿瘤或其它病变时，破坏前列腺和淋巴系统组织间屏障，富含前列腺特异抗原的腺泡内容物漏入淋巴系统，并相继进入血液循环，使外周血中前列腺特异抗原升高。前列腺特异抗原是目前公认的唯一具有器官特异性的血清肿瘤标志物。血清前列腺特异抗原升高一般提示前列腺存在病变（前列腺炎、良性前列腺增生、前列腺癌）。检测血清或血浆前列腺特异抗原含量，不仅可在高危人群中早期发现前列腺癌，同时也可用于前列腺癌患者治疗后的监控、手术治疗效果评估等方面。

前列腺特异抗原具有良好的免疫原性，能制备特异性抗体并通过免疫化学原理进行测定。标记免疫分析根据标记物不同分为放射免疫分析、酶免疫分析和发光免疫分析，血清前列腺特异抗原主要采用酶免疫分析和电化学发光免疫分析。无论采用何种分析方式，其检测原理基本相同，即采用双抗体夹心法测定未知前列腺特异抗原：将其中一种抗体与固相载体连接作为捕获抗体，用于捕获待测标本中前列腺特异抗原；将另一种抗体与示踪物质（辣根过氧化物酶或三联吡啶钌）结合作为标记（检测）抗体，当标记抗体与前列腺特异抗原结合后，在固相载体表面形成捕获抗体-待测抗原-标记抗体复合物。将固相载体洗涤，去除过剩标记物或未参加反应的成分；酶免疫分析通过加入底物，通过酶促反应强度，对未知抗原进行定量分析。而电化学发光再加入三丙胺与电极表面发生氧化还原反应，通过光信号对未知抗原进行定量分析。

酶免疫分析检测前列腺特异抗原的主要优势表现在：检测试剂已实现国产化、酶标仪普及程度高；因此，酶免疫分析具有较低检测成本，能够在基层医院开展工作。但是，由于采用辣根过氧化物酶作为示踪物质，稳定性较差且酶活性干扰因素较多，导致酶免疫分析的精密度不够理想。此外，酶免疫分析采用微孔反应板作为固相材料，由于包被抗体的限制，不能实现理想检测范围。电化学发光免疫分析是目前检测性能较高标记免疫分析技术，具有较高的自动化水平，较高的检测性能（敏感度、精密度、稳定性等方面）。但是，电化学发光检测仪昂贵，检测试剂依赖进口，从而使检测成本很高，且基础医疗单位很难开展。基于上述原因，酶免疫分析法主要用于前列腺癌高危人群的筛查，而电化学发光免疫分析主要用于前列腺癌患者确诊和手术治疗效果评估以及监测肿瘤复发等方面。

在标记免疫分析中，由于标记抗体（或抗原）在反应体系中是过量的，反应达到平衡后，体系中仍存在剩余的、未结合抗原的标记抗体。其中，非均相免疫分析采用固相吸附法分离结合标记物和游离标记物。固相吸附分离法是将抗原（抗体）吸附在固相载体表面，使免疫反应在固相载体表面上进行，待测物质（抗体或抗原）、标记抗体（抗原）均可通过免疫反应结合在固相材料表面，未结合物质（含游离标记物）存在于液相中。此时，弃去液相并经洗涤，便可去除游离标记物。酶联免疫分析和电化学发光免疫分析检测血清中前列腺特异抗原，两种检测方法的从检测原理上均属于非均相免疫分析，酶免疫分析采用酶联免疫反应板作为固相材料，电化学发光免疫分析采用磁性微球作为固相材料。

固相吸附分离方法有两个重要环节：包被和洗涤。固相吸附分离方法设计巧妙，操作简单，故应用非常广泛。但是，此种非均相反应模式因包被和洗涤环节的存在，给标记免疫分析造成很大缺陷，主要表现在以下两个方面：

1.在包被过程，无论物理吸附还是化学连接，包被后固相材料表面的抗体分子其构象不同于处于液相中的抗体分子，与抗原分子结合能力因空间位阻效应将受到一定限制；无论采用微球还是微孔板作为固相材料，由于包被面积有限，捕获抗体分子不能最大限度满足大量待测抗原的需要，由此将影响检测范围。

2.“洗板”或“洗球”是非均相免疫分析中的重要环节且多次出现。洗涤过程增加检测程序的复杂性，增加检测时间并给实现自动化带来障碍。此外，由于洗涤过程特别是酶免疫分析，难于实现标准化，每个测试孔之间洗涤效果不同，在一定程度上影响检测的精密度，出现批间、批内差异。