[发明专利]一种新的松材线虫检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病虫害的检疫领域，提供了一种利用PCR扩增和核酸试纸条联合检测技术快速检测松材线虫的方法及其试剂盒，适用于口岸检验检疫机构应用。 

背景技术

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是当前严重威胁和危害松林安全的最主要的有害生物，其引发的松材线虫病是当前世界四大林木病害之一。该病害主要是通过松类植物及其产品的调运传播，是一种松树毁灭性的病害，一旦发生，难防难治，会造成巨大的经济损失。该病害主要分布于美国、加拿大、日本等多个国家。我国于1982年在南京中山陵首次发现松材线虫，随后，又相继在江苏、安徽、广东等地的局部地区以及香港、台湾地区陆续发现，对我国局部地区的森林造成了巨大的破坏，因此加强口岸检疫尤为重要。 

研究高效、快速、灵敏的松材线虫检验检测技术是有效地发现和控制病害的重要手段。为了寻找准确、快速的检测方法，很多学者在线虫的形态学、遗传学、免疫学、病理学和生物化学方面做了深入研究，并研究出了如pH值检测法、纤维素酶扩散检测法等检测方法，对于松材线虫的检测起到了积极的作用，但这些方法受到松材线虫生长发育期、虫口数量、实验条件稳定性等方面的限制，在实际应用过程中具有一定的局限性。 

近些年来，随着分子生物学和生物技术的快速发展，研究人员应用分子生物学的方法来检测松材线虫，以克服由于传统方法带来的不足。PCR-RAPDL、PCR-RFLP和PCR-SSCP技术等分子生物检测方法虽然提高了检测的准确性，但这些方法对技术人员和实验条件要求较高，从而这些方法在的推广使用，因此寻求一种简单、快速、准确的检测方法仍是当前在生产实际中急需解决的问题。 

本研究通过巧妙地设计针对松材线虫的带标记的特异性引物和竞争性引物，应用PCR扩增和核酸试纸条联合检测技术，实现了松材线虫的高效快速检测。该方法特异性强，灵敏度高和稳定性好，对于提高线虫检测的准确性、缩短检测时间具有重要的作用。方便快捷，节约成本和时间，原理和操作简单，不需特殊仪器，适合检验检疫部门运用和推广，同时对其他线虫的快速检测也具有重要的借鉴意义。 

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供用于检测松材线虫的特异性引物和竞争性引物。 

本发明需要解决的另一问题是提供包含上述引物的PCR检测试剂盒。 

本发明用于检测松材线虫的PCR引物序列为： 

上游引物Bx-F3-bio：5’biotin-TCTGCACGTTGTGACAGTC-3’ 

下游引物Bx-B3-fit：5’fitc-TCATCCGAACGTCCCTGAC-3’ 

竞争引物Bx-B3-comp：5’-GTCAGGGACGTTCGGAACT-3’ 

本发明的松材线虫检测试剂盒，包括以下成分： 

(1)松材线虫DNA模板和阴性对照拟松材线虫DNA模板 

(2)松材线虫上下游引物和竞争引物 

上游引物Bx-F3-bio：5’biotin-TCTGCACGTTGTGACAGTC-3’ 

下游引物Bx-B3-fit：5’fitc-TCATCCGAACGTCCCTGAC-3’ 

竞争引物Bx-B3-comp：5’-GTCAGGGACGTTCGGAACT-3’ 

(3)10×ExTaq PCR Buffer，DDH₂O，2.5mM dNTP，5U/μl ExTaq酶 

用上述方法对待测样品DNA进行PCR扩增，PCR产物用试纸条检测，若控制线正常，检测线呈现阳性，则说明该样品含有松材线虫，若呈现阴性，则说明该样品中不含有松材线虫。 

与现有技术相比，本发明的进步在于：使用仪器简单，无需琼脂糖凝胶电泳、紫外凝胶成像，从而避免了溴化乙锭的污染，节省时间，特异性强，灵敏度高，稳定性好，降低了实验室的投入，适合基层实验室推广使用。 

附图说明

图1为松材线虫试剂盒特异性测试结果，1为阴性对照，2、3为拟松材线虫，4为豆伞滑刃线虫，5为食菌伞滑刃线虫，6为莱奴尔夫伞滑刃线虫，7为真滑刃属线虫(Aphelenchus SP.)的一种，8、9为松材线虫，从图1可以产出本试剂盒能准确地检测出松材线虫 

具体实施方式

PCR引物设计：