[发明专利]直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物及方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用分子生物学方法对植物有害线虫进行检测的技术领域，具体涉及直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物及方法。

背景技术

根结线虫（Meloidogyne）是植物根系专性内寄生物，分布遍及世界大部分地区。因其适应性强、传播途径多样、可侵染多种植物，而成为世界性威胁农业生产的主要病原物，给农业生产者造成极大的经济损失。肾形肾状线虫（Rotylenchulus reniformis），作为肾状线虫属的模式种，对农业生产危害严重，主要发生在热带和亚热带地区，寄主范围广，在葫芦科（Cucurbitaceae）、茄科（Solanaceae）和豆科（Leguminosae）等各种蔬菜作物以及其它多种经济作物上侵染寄生。瓜类作物由于肾形肾状线虫侵染与寄生，引起根皮层组织坏死、根变褐，植株矮化、叶片发黄、变小，进而导致产量下降。根据我们2009-2011年对我国8个省市26个地区57份黄瓜根围土壤植物寄生线虫的调查鉴定，根结线虫和肾形肾状线虫检出率分别为59.6%和63.2%，为黄瓜根围主要植物寄生线虫。

土壤是植物寄生线虫主要生存场所。目前常规的线虫鉴定方法，无论是形态鉴定还是分子鉴定，都需要先将土壤中的线虫分离出来，费时费力。因此，探索直接从土壤中提取DNA方法，进而直接对根结线虫和肾形肾状线虫进行快速分子检测，对作物线虫病害的有效防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中不能从土壤中直接同时检测根结线虫和肾形肾状线虫的不足，提供一组能直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物。

本发明的另一目的是提供一种直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一组直接检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物，核苷酸序列如下：

D2A：SEQ ID NO:1（5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3'）；

D3B：SEQ ID NO:2（5'-TGCGAAGGAACCAGCTACTA-3'）；

NF3：SEQ ID NO:3（5’- GTGAGGGAAAGTTGCAAAGCACT -3’）；

NR0：SEQ ID NO:4（5’- GTTCACCATCTTTCGGGTCTCAC -3’）；

MF0：SEQ ID NO:5（5’- GGGGATGTTTGAGGCAGATTTG -3’）；

和RF4：SEQ ID NO:6（5’- GGTCTGGCTCCCATGTTTTCCA -3’）。

一种直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，步骤如下：

（1）提取待测土壤DNA、纯化；

（2）巢式PCR扩增：进行两轮PCR扩增反应，第一轮以待测土壤DNA为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2（D2A和D3B）所示的线虫通用引物进行PCR扩增；第二轮以第一轮PCR产物为模板，SEQ ID NO:3～6所示的引物进行PCR扩增；

（3）结果分析：

① 第二轮PCR扩增产物含有617~624bp和424~431bp的序列，表明待测土壤中含有根结线虫（如果使用电泳检测，判断标准为在600bp和400bp左右出现扩增片段条带）；

② 第二轮PCR扩增产物含有644bp和265bp的序列，表明待测土壤中含有肾形肾状线虫（电泳检测标准为在600bp和250bp左右出现扩增片段条带）；

③ 第二轮PCR扩增产物含有617~644bp、424~431bp和265bp的序列，表明待测土壤中同时含有根结线虫和肾形肾状线虫（电泳检测标准为在600bp、400bp和250bp左右出现3条扩增片段）。

作为一种优选方案，上述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法中，步骤（3）结果分析中①第二轮PCR扩增产物含有617bp和424bp的序列时，表明待测土壤中含有南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、纳西根结线虫和/或象耳豆根结线虫；扩增产物中含有620bp和427bp的序列时，表明待测土壤中含有北方根结线虫；扩增产物中含有624bp和431bp的序列时，表明待检测土壤中含有拟禾本科根结线虫和/或禾本科根结线虫。