[发明专利]直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物及方法

权利要求书

1.一组直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物，其特征在于核苷酸序列如下：

D2A：SEQ ID NO:1； 

D3B：SEQ ID NO:2；

NF3：SEQ ID NO:3；

NR0：SEQ ID NO:4；

MF0：SEQ ID NO:5；

和RF4：SEQ ID NO:6。

2.   一种直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤如下：

（1）提取待测土壤DNA、纯化；

（2）巢式PCR扩增：进行两轮PCR扩增反应，第一轮以待测土壤DNA为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的线虫通用引物进行PCR扩增；第二轮以第一轮PCR产物为模板，SEQ ID NO: 3～6所示的引物进行PCR扩增；

（3）结果分析：

① 第二轮PCR扩增产物含有617~624bp和424~431bp的序列，表明待测土壤中含有根结线虫；

② 第二轮PCR扩增产物含有644bp和265bp的序列，表明待测土壤中含有肾形肾状线虫；

③ 第二轮PCR扩增产物含有617~644bp、424~431bp和265bp的序列，表明待测土壤中同时含有根结线虫和肾形肾状线虫。

3.根结权利要求2所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤（3）结果分析中①第二轮PCR扩增产物含有617bp和424bp的序列时，表明待测土壤中含有南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、纳西根结线虫和/或象耳豆根结线虫；扩增产物中含有620bp和427bp的序列时，表明待测土壤中含有北方根结线虫；扩增产物中含有624bp和431bp的序列时，表明待检测土壤中含有拟禾本科根结线虫和/或禾本科根结线虫。

4.根据权利要求2所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤（1）中提取待测土壤DNA使用的抽提缓冲液为：20mM EDTA，1.5M NaCl，500mM Tris-HCl，质量体积比为10%的SDS水溶液，质量体积比为1%的PVP水溶液；其中Tris-HCl的pH值为8.0。

5.根据权利要求2所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤（1）中的纯化是使用试剂盒PowerClean? DNA Clean-Up Kit。

6.根据权利要求2所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤（1）提取待测土壤DNA具体为：

①待检测土壤与预热的抽提缓冲液混匀；

②加入蛋白酶K，混匀后在65℃下消化1小时后震荡10min；

③12000g室温离心5min，取上清加入Tris-饱和苯酚，颠倒混匀，4℃ 12,000g离心10min；

④将上清转入干净的离心管，加入氯仿体和异戊醇积比为24：1的混合液，颠倒混匀，4℃ 12,000g离心10min；

⑤将上清转入干净的离心管，加入3M，pH 5.2的冰醋酸，加入量为上清体积的1/10，再加入上清体积2倍的冷无水乙醇，混匀后–20℃静置20min，4℃ 12,000g离心10min，弃尽上清；

⑥分别用体积百分含量为70%的乙醇和无水乙醇各洗沉淀一次，室温晾干；

⑦加灭菌双蒸水复溶，可得到粗提的土壤DNA。

7.根据权利要求2所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤（2）第一轮PCR的反应体系为：2×PCR buffer 12.5 μL，2mmol/L dNTPs 5 μL，10μmol/L 引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.5μL， KOD Fx 0.5μL，DNA模板1.0 μL和余量的ddH₂O，共 25.0μL；

PCR扩增条件为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃后延伸5 min。