[发明专利]一种鉴定胡椒种质资源的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物信息技术领域，具体的说是涉及一种鉴定胡椒种质资源的方法。

背景技术

胡椒（Piper nigrum L.）为胡椒科胡椒属多年生常绿攀援藤本植物，是世界重要的香辛料作物，用途广，经济价值高。胡椒的种子含有挥发油、胡椒碱、粗脂肪、粗蛋白等成分，是人们喜爱的调味品。除此之外，胡椒在医药工业上可用作健胃剂、解热剂及支气管粘膜刺激剂等，治疗消化不良、寒痰、咳嗽、肠炎、支气管炎、感冒和风湿病等；在食品工业上用作防腐剂及天然食品添加剂等。

胡椒种苗的真实性是衡量种苗质量的重要指标，直接影响胡椒的产量、品质和经济效益。当前我国胡椒种子和种苗常存在纯度低、品种混杂、以次充好现象，各级农作物品种审定机构和种子种苗生产部门对胡椒品种伪劣鉴定日益重视。但是，胡椒种质资源形态特征较为相似，加上长期引种和生产管理疏漏，导致了同物异名、同名异物、品种混淆等问题。传统形态鉴定法依赖于表型差异，而形态性状受到气候、环境、营养状态和生物期等多种因素影响，且形态鉴定法工作量大、鉴定周期长、成本高，对于种苗鉴定、推广品种以及育种等工作造成不利影响。

DNA分子标记能反映生物个体或种群基因组中某种差异特征的DNA片段，可以从根本上揭示植物内在的基因差异，近年来已经广泛应用到作物品种鉴定和种质资源分类等研究领域。目前，应用较多的是SSR、ISSR、RAPD、RFLP和AFLP等分子标记。其中，ISSR（Inter-simple sequence repeat），即简单序列重复区间扩增，是由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等于1994年创建的一种分子标记技术，其原理是在SSR的3＇或5＇端锚定1-4个碱基作为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段序列进行扩增，而不是扩增SSR本身。锚定碱基避免了SSR在基因组上的滑动，因而大大提高了PCR扩增的稳定性和可重复性。

ISSR分子标记技术兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信息而大大降低成本，且多态性更加丰富；与RAPD相比，ISSR退火温度在50℃左右，保证了PCR扩增的稳定性和重复性；与RFLP、AFLP相比，ISSR利用在植物基因组中常出现的简单重复序列设计引物，无需预先克隆和测序，技术要求不高、速度较快、成本低廉。目前，ISSR标记技术在种质资源的准确鉴定、遗传多样性、基因定位、遗传图谱构建及分子标记辅助选择等研究中得到了广泛应用。但在胡椒中，应用ISSR分子标记技术进行胡椒种质资源鉴定的方法尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴定胡椒种质资源的方法，使该方法能够利用ISSR分子标记技术准确、简便的鉴定胡椒种质资源。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种鉴定胡椒品种的方法，包括以下步骤：

步骤1、选取标准胡椒品种中的一种或两种以上，分别进行DNA提取，然后采用SEQ ID NO:1所示序列的ISSR引物进行PCR扩增，所得扩增产物进行凝胶电泳检测，根据凝胶电泳图结果以标准胡椒品种编号和扩增条带数最多的标准胡椒品种的条带存在位点编号为横、纵坐标，在每一个横、纵坐标交结处记录标准胡椒品种条带的检测结果，将有扩增条带的标记为有条带，无扩增条带的标记为无条带，得到标准胡椒品种的ISSR指纹图谱；

步骤2、提取待测胡椒品种的DNA，采用SEQ ID NO:1所示序列的ISSR引物进行PCR扩增，将所得到的扩增产物进行凝胶电泳检测，根据凝胶电泳图结果以待测胡椒品种编号和步骤1所述扩增条带数最多的标准胡椒品种的条带存在位点编号为横、纵坐标，在每一个横、纵坐标交结处记录待测胡椒品种条带的检测结果，将有扩增条带的标记为有条带，无扩增条带的标记为无条带，得到待测胡椒品种的ISSR指纹图谱，然后与所述标准胡椒品种的ISSR指纹图谱进行比对判断。

其中，作为优选方案，本发明所述PCR扩增体系为：反应总体积为25μL，其中Mg2+浓度为2mmol/L、dNTPs浓度为200μmo/L、引物浓度为2μmol/L、胡椒品种的DNA用量为100ng、Taq DNA聚合酶用量为1U；

所述PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性2min、50℃复性1min、72℃延伸3min，循环35次；72℃延伸7min，4℃保存。