[发明专利]一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法，还涉及一种无血清或无动物源性成分的培养基及其在制备口蹄疫疫苗中的应用。属于生物技术领域。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病，以传播迅速、感染率高而著称。该病一旦爆发将对发病国造成巨大的经济损失，世界各国对该病的研究极为重视，国际兽医局将其列为A类传染病之首。口蹄疫属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，有A、O、C、Asia I、SA T1、SA T2和SA T3型7个血清型。目前我国口蹄疫的防制仍以预防为主。尽管传统疫苗在口蹄疫预防控制中仍占主导地位，但生产成本昂贵，免疫期短，疫苗制备过程中病毒逃逸等危险因素很难避免。因此，传统疫苗亟需加以改进，研制安全、高效的口蹄疫疫苗仍显得非常必要。

随着家畜集约化养殖水平的提高，尤其是奶牛饲养量的增大，疫苗的轻微副反应，就可带来巨大的经济损失，如怀孕牛流产、泌乳牛产奶量下降、乳品质下降等，无任何副反应的疫苗在市场上有巨大的需求空间。

现有的口蹄疫灭活疫苗主要存在以下两个问题：1.免疫保护力不稳定，主要表现在：免疫后检测不到中和抗体或者抗体水平很低，或者免疫期较短，只有2～3个月；2.免疫副反应大，主要是：下游生产工艺仍为传统方法，未经纯化处理，疫苗中存在一些培养基和宿主细胞中的杂质及过敏性物质，而且有效抗原含量低。这对口蹄疫的免疫防控工作带来极大的影响。

从采用的培养基上看，含有动物源血清或成分的培养基使得在病毒培养或疫苗生产中遭受外源污染的风险升高，因此使用无有动物源血清或成分的培养基降低生产中的污染风险，并且能够排除牛血清杂蛋白在疫苗使用引起的应急反应，也降低了疫苗污染外源因子的风险。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种适用于BHK-21细胞或BSR细胞培养的无血清或无动物源性成分的培养基。

本发明的目的之二在于提供一种利用本发明的培养基生产口蹄疫纯化疫苗的方法及由该方法制备得到的口蹄疫纯化疫苗。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种无血清或无动物源性成分的培养基，其特征在于每升所述的培养基中含有以下成分：350-400mg L-丙氨酸，80-100mg L-盐酸精氨酸，250-300mg L-天冬氨酸，50-90mg L-盐酸半胱氨酸，100-140mg L-谷氨酸，25-75mg L-精氨酸，80-120mg L-酪氨酸，110-150mg L-缬氨酸，2.0-3.0Kg蔗糖，80-120mg枸缘酸钠，7.0-8.0Kg NaCl，280-320mg KCl，180-220mg CaCl₂以及15-25mg酚红，蒸馏水补足1000ml。

在本发明的一种无血清或无动物源性成分的培养基，优选的，每升所述的培养基中含有以下成分：380mg L-丙氨酸，90mg L-盐酸精氨酸，280mg L-天冬氨酸，70mgL-盐酸半胱氨酸，120mg L-谷氨酸，50mg L-精氨酸，100mg L-酪氨酸，130mg L-缬氨酸，2.5Kg蔗糖，100mg枸缘酸钠，7.5Kg NaCl，300mg KCl，200mg CaCl₂以及20mg酚红，蒸馏水补足1000ml。

本发明还提供了所述的培养基在培养BHK-21细胞或BSR细胞中的应用。

进一步的，本发明还提供了一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）BHK-21细胞的培养：采用权利要求1或2所述的培养基对BHK-21细胞进行微载体悬浮培养；

（2）病毒接种与培养：步骤（1）中BHK-21细胞在生物反应器中培养6-7天后，停止搅拌，微载体沉入反应器底部，放出细胞培养液后，加入含有0.15g/L葡萄糖的MEM培养液，搅拌0.5-1.0h，放出洗液，加入口蹄疫病毒液，使每个细胞感染的病毒颗粒达0.1-0.5TCID₅₀，吸附一小时，补加培养液，培养72~96小时，进行收获，同时用0.22μm的膜过滤，4℃保存；

（3）病毒的浓缩和纯化：采用中空纤维柱对病毒液进行澄清、微滤、浓缩后，采用连续流蔗糖密度梯度离心或分子筛层析柱对滤液进行纯化；

（4）病毒的灭活及疫苗的制备。

在本发明中，优选的，步骤（1）中所述的BHK-21细胞传代在10个代次内。