[发明专利]一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种无血清或无动物源性成分的培养基，其特征在于每升所述的培养基中含有以下成分：350-400mg L-丙氨酸，80-100mg L-盐酸精氨酸，250-300mg L-天冬氨酸，50-90mg L-盐酸半胱氨酸，100-140mg L-谷氨酸，25-75mg L-精氨酸，80-120mgL-酪氨酸，110-150mg L-缬氨酸，2.0-3.0Kg蔗糖，80-120mg枸缘酸钠，7.0-8.0KgNaCl，280-320mg KCl，180-220mg CaCl₂以及15-25mg酚红，蒸馏水补足1000ml。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于每升所述的培养基中含有以下成分：380mg L-丙氨酸，90mg L-盐酸精氨酸，280mg L-天冬氨酸，70mg L-盐酸半胱氨酸，120mg L-谷氨酸，50mg L-精氨酸，100mg L-酪氨酸，130mg L-缬氨酸，2.5Kg蔗糖，100mg枸缘酸钠，7.5Kg NaCl，300mg KCl，200mg CaCl₂以及20mg酚红，蒸馏水补足1000ml。

3.权利要求1或2所述的培养基在培养BHK-21细胞或BSR细胞中的应用。

4.一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）BHK-21细胞的培养：采用权利要求1或2所述的培养基对BHK-21细胞进行微载体悬浮培养；

（2）病毒接种与培养：步骤（1）中BHK-21细胞在生物反应器中培养6-7天后，停止搅拌，微载体沉入反应器底部，放出细胞培养液后，加入含有0.1%葡萄糖的MEM培养液，搅拌0.5-1.0h，放出洗液，加入口蹄疫病毒液，使每个细胞感染的病毒颗粒达0.1-0.5TCID₅₀，吸附一小时，补加培养液，培养72~96小时，进行收获，同时用0.22μm的膜过滤，4℃保存；

（3）病毒的浓缩和纯化：采用中空纤维柱对病毒液进行澄清、微滤、浓缩后，采用连续流蔗糖密度梯度离心或分子筛层析柱对滤液进行纯化；

（4）病毒的灭活及疫苗的制备。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述的BHK-21细胞传代在10个代次内。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于向步骤（1）中所述的培养基中加入Cytodex-3微载体，使微载体的浓度达5~8g/ml。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（2）中所述的口蹄疫病毒为A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、C型口蹄疫病毒、SAT-1、SAT-2或SAT-3型口蹄疫病毒。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于生物反应器体积在750L以上，搅拌速度为25-45rpm，病毒培养温度为35℃，溶氧20%，pH 7.4。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于采用中空纤维柱对病毒液进行50~200倍的超滤浓缩。

10.由权利要求4-9任一项所述的方法制备得到的口蹄疫纯化疫苗。