[发明专利]一种S-木薯羟腈裂解酶的提取方法及其在手性合成乙酸氰醇酯中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药和精细化工产品的制备技术领域，具体地说是一种直接使用有机溶剂沉淀法从木薯叶中分离提取S-木薯羟腈裂解酶（S-MeHNL）的简单、高效的方法，并将其作为手性催化剂应用在催化醛与各种氰源的手性加成反应中，合成得到手性氰醇及其乙酸酯。 

背景技术

S-手性氰醇及其酯是一类具有重要价值的手性源。它可以方便地转化为具有S-构型的α-羟基酮、α-羟基醇、β-胺基醇、氨腈、氮啶、咪唑杂环等重要的合成手性药物及中间体的重要原料。在非手性催化剂或无催化剂的条件下，醛与HCN的加成一般只能得到外消旋的氰醇产物；所以，需要使用拆分或手性催化剂才能得到S-手性氰醇及其酯。S-氰醇的生物催化合成，一般使用S-羟氰裂解酶作为手性催化剂。而S-羟氰裂解酶分布不如R-羟氰裂解酶那样广泛，目前发现它只存在于橡胶、木薯和高粱嫩叶等少数几种植物组织中，并且丰度较低，纯化难度大。其中，木薯是一种在100多个国家广泛被种植的重要农作物。Effenberg等（Wajant, H.; Forster, S.; Bottinger, H.; Effenberger, F.; Pfizenmaier, K. Plant sci., 1995, 108, 1.）发现：木薯中含有的S-木薯羟腈裂解酶（S-MeHNL），可催化醛或酮和HCN合成手性氰醇。Effenberg等并通过五步法分离得到了S-木薯羟腈裂解酶，分别为：粗酶液的提取；凝胶层析；阴离子交换层析（pH 5.8）；凝胶过滤层析；再次阴离子交换层析（pH 7.5）。然后将获得的S-木薯羟腈裂解酶固定在硝基纤维上作为催化剂，催化芳醛、脂肪醛和杂环醛与HCN加成合成手性氰醇，苯甲醛的氰醇产物ee值较高(90%)，但收率只有34%；其它产物的ee值和收率都不理想(Scheme 1)。 

White等也尝试了用三步法从木薯叶中提取了S-木薯羟腈裂解酶：即先从木薯叶中提取了粗酶液，再用盐析法（50%硫酸铵水溶液）析出S-木薯羟腈裂粗酶，并透析24 h以除去粗酶中含有的盐（硫酸铵）。在此基础上White等对S-木薯羟腈裂解酶部分酶学性质进行了研究，但没有达到催化合成手性氰醇的要求(White, W. L. B.; Arias-Garzon, D. I.; McMahon, J. M.; Sayre, R. T. Plant Phsiol. 1998, 116, 1219.)。 

以上这些S-木薯羟腈裂解酶提取方法存在：酶的收率低、纯度低、酶催化反应效果差等问题。 

因此，科学家们将希望寄于基因工程的方法上。如Effenberger等(Forster S., Roos J., Effenberger F., et al .Angew Chem. Int. Ed. Engl. , 1996, 35: 437.)将S-木薯羟氰裂解酶（S-MeHNL）在大肠杆菌等中成功表达，通过基因重组的方法获得MeHNL，并将其作为催化剂应用到S-氰醇的合成上，取得了较好的效果。程树华等(程树华,严共鸿,吴襟,孙万儒，生物工程学报，2001，17（1），78.) 也成功地将S-木薯羟氰裂解酶克隆于质粒pPIC9K，在大肠杆菌获得高效表达。重组羟腈酶的催化活性较高。 

虽然S-木薯羟氰裂解酶在基因工程的研究取得了较大的进展，但由于获得的重组酶活性通常稳定性差，浓度低，到目前为止，该技术还难以达到实际应用的阶段。 

如上所述, S-木薯羟氰裂解酶在木薯叶中丰度虽然低，但由于木薯叶是一种来源丰富的可再生资源，价廉易得。若能研究开发出:一种能简易、经济、有效地从木薯叶中提取具有高催化活性的S-羟氰裂解酶的方法，并将其作为手性催化剂直接应用于S-氰醇及其乙酸酯的手性加成反应，则实际应用价值很大。 

发明内容