[发明专利]一种高效表达Hst 5的重组工程菌及构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药及食品领域，尤其是一种高效表达Hst 5的重组工程菌及构建方法和应用。 

背景技术

细菌对抗生素的耐药性已成为当今临床医学上的一个难题，新型抗生素的研究速度远远赶不上细菌耐药性的步伐。自90年代以来，对抗菌肽等新型抗菌物质的研究日益增加，其中防御素、富组蛋白（Histatin）等抗菌活性肽家族是人体免疫系统的天然成分，具有抗菌活性强、毒副作用小，耐药菌株少等优点，备受关注。由细菌、酵母和霉菌等微生物造成的食物、饲料等的腐败变质，使相关产品降低或失去原有价值，甚至产生毒素，造成人畜中毒、患病甚至致死。在食品、饲料中添加抗生素或化学防腐剂（苯甲酸盐、尼泊金、亚硝酸盐、硝酸盐等），不仅对人畜具有一定的副作用，而且易造成细菌耐药性的泛滥，因此，开发安全性好的新型生物防腐剂日益受到人们的关注。 

富组蛋白是一族富含组氨酸的小分子、阳离子肽，由人体的腮腺和下颌下舌下腺分泌至唾液，其中以富组蛋白5（Hst 5）的活性最强，抑菌谱广，对细菌、酵母、霉菌、病毒等多种微生物具有显著的抑制作用，是一种十分有前景的新型抗菌药物及防腐剂，目前已在美国进入II期临床试验，用于囊性纤维化感染的治疗。 

乳酸菌是一类以糖为原料产生乳酸的细菌，具有提高食品营养价值、改善食品风味、延长保存时间、对人畜安全无害且具有多方面保健功能的益生菌，因此被视为理想的蛋白多肽类物质的口服载体与表达载体。 

目前，国内外生产Hst 5多采用化学合成方法，成本较高。虽亦有Hst 5基因工程表达的文献报道，但所用多为大肠杆菌、毕赤酵母等表达体系，纯化困难，且无法直接作为食品、饲料防腐添加剂使用，因此均难以产业化应用于实际中。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高效表达Hst 5的重组工程菌及构建方法和应用，本发明获得的工程菌将Hst 5直接分泌表达到培养液中，因此降低了分离纯化难度、缩短了生产工艺，降低了生产成本，便于更好的大规模工业化生产Hst 5，可作为一种优良、安全的生物防腐剂及发酵剂应用于食品、药品、饲料等产品生产中。 

本发明实现目的的技术方案如下： 

一种高效表达Hst 5的重组工程菌，其特征在于：所述重组工程菌包括Hst 5基因，其序列见序列6，所述重组工程菌的表达质粒为pMG36e，所述重组工程菌的宿主菌为乳酸菌。 

而且，所述乳酸菌包括乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌。 

一种高效表达Hst 5的重组工程菌的构建方法，其特征在于：构建方法如下： 

⑴构建N端引入乳酸菌信号肽的Hst 5基因，Hst 5基因序列见序列6； 

⑵将Hst 5基因插入到乳酸菌表达载体的多克隆位点，构建得到Hst 5重组质粒，所述重组质粒为pMG36e-Hst 5； 

⑶将Hst 5重组质粒转化至宿主菌，所述宿主菌为乳酸菌，得到Hst 5重组乳酸菌。 

而且，所述步骤⑴中N端引入乳酸菌信号肽的Hst 5基因通过DNA合成或重叠PCR方法获得，在采用重叠PCR方法时，所用引物序列包括： 

在引物P3、P4中分别引入SalI和HindIII酶切位点，下划线部分，重叠PCR分为两步：第一步，以P1和P2引物互为模板进行PCR扩增；第二步，以第一步获得的PCR产物为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增得到目的基因。 

一种高效表达Hst 5的重组工程菌作为防腐添加剂的应用。 

一种高效表达Hst 5的重组工程菌作为发酵剂的应用。 

本发明的有益效果和优点是： 

1、本发明的方法成功实现了Hst 5在重组乳酸菌中的高效表达，分泌到培养基中，检测结果显示Hst 5重组质粒在重组乳酸菌中拥有较高的遗传稳定性，Hst 5重组乳酸菌发酵液或直接将Hst 5重组乳酸菌与指示菌共培养，能够显著抑制革兰阳性细菌（S.aureus等）、假丝酵母菌（C.albicans等）、霉菌（A.niger等）等微生物，直接将Hst 5重组乳酸菌加入鸡肝等食品材料中，也可明显抑制食品的腐败变质，可为食品、药品、饲料等行业提供一种优良、安全的生物防腐剂及发酵剂。 

2、本发明的方法在生产Hst 5时，由于将Hst 5直接分泌表达到培养液中，因此降低了分离纯化难度、缩短了生产工艺，降低了生产成本，便于更好的大规模工业化生产Hst 5。