[发明专利]大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法

说明书

 

技术领域

本发明属于抗肝癌药物制备技术领域，涉及大规模制备中期因子反义寡合苷酸纳米脂质体的方法。

 

背景技术

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种高侵袭性、高转移性的实体恶性肿瘤，但还缺乏理想的治疗方法。

中期因子（midkine，MK）是一个新发现的促血管生成因子，它是一种具有促细胞转化、促有丝分裂作用、促肿瘤血管生成、抗细胞凋亡和增强纤维蛋白溶解等肿瘤形成相关活性的碱性肝素结合性蛋白质，仅在胚胎中期和成年肾脏表达。已有的研究表明，在肝癌等许多人类肿瘤组织中MK mRNA及蛋白均呈高度表达，而各种正常组织仅有低水平表达或无表达，并与肝癌的发生、浸润转移，血管生成及预后密切相关，而血管生成是肝癌无限制侵袭，生长和转移的基础。因此，MK可能是抗血管生成治疗肝癌的理想靶位。

反义寡合苷酸是具有专一序列的寡聚脱氧核苷酸，能特异阻断靶基因的复制、转录和翻译，是基因治疗的一种方法。我们筛选的中期因子反义寡核苷酸（MK-ASODN序列: CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA）已经证实在体内外具有明显的抗肝癌作用，有希望成为一种新的肝癌治疗靶点。但是，由于反义寡核苷酸为高度亲水性物质，表面带有很强的负电荷，因此很难穿过细胞膜，并且在血液中容易被各种酶类降解而不稳定，所以需要有合适的基因递送载体将反义寡核苷酸递送到靶细胞。

脂质体，是由磷脂双层膜构成的中空小球。早在1965年英国人Bangham就发现了脂质体，此后人们发现脂质体作为药物载体有着巨大的价值，它能够降低药物本身的毒性并在一定程度上增强药效。目前已经上市的脂质体药物已有很多，如脂质体两性霉素（商品名：AmBisome），脂质体阿霉素（Myocet）和脂质体柔红霉素（DaunoXome），这些药物都通过了FDA的认证，上市生产，因此，就脂质体在临床上使用的安全性已经得到了肯定。1992年，Ropert首次将脂质体用于ASODN的递送，并制成了纳米脂质体。

纳米脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型，不同粒径大小的纳米脂质体可以聚积在不同的脏器，大部分的纳米脂质体会被动靶向于肝脏，有利于MK-ASODN在肝脏中发挥作用。

注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的规模化生产需要反义核酸和脂质体都能进行大规模的生产与制备。随着DNA自动合成仪的发展，反义寡核苷酸的一次合成量已经达到1000mmol/L，完全可以达到规模化生产的级别。而脂质体的制备方法经历了20多年的发展，分别有薄膜分散法、逆向蒸发法，去污剂透析法、溶剂注入法等，很多方法都只能进行实验室规模的小试。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法，该方法主要是建立在溶剂注入法的基础之上，形成一个自动化的过程，还克服了传统的溶剂注入法中规模小、根据本发明生产的注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体，粒径在100~500nm之间，性质稳定，抗肝癌作用显著增强。过程简单，容易实现，且非常容易放大，适合于工业化生产。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是：

该方法包括以下步骤： 

（1）制备脂质溶液：该脂质溶液是由包含二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）和3-β-[N-（N’,N’-二甲基氨基乙基）]氨甲酰基胆固醇（DC-Chol）的原料溶解到有机溶剂中，搅拌至溶液澄清透明，有机溶剂的用量使阳离子脂质和磷脂恰好完全溶解，得脂质溶液，溶液温度为20~60℃，

上述原料摩尔百分比组成为：二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）5-95%、3-β-[N-（N’,N’-二甲基氨基乙基）]氨甲酰基胆固醇（DC-Chol）95-5%；

（2）采用交叉流技术使脂质溶液与水化溶剂按体积比1：50～3：17混合，混合后得到的粗脂质体通过超声仪超声，初步分散，通过施压将脂质体通过铺有聚碳酸脂膜的挤压器统一粒径；

（3）流出的脂质体混悬液通过超滤器超滤，除去有机溶剂，超滤时连续补充脂质体水化溶剂，得到空白的纳米脂质体，制成的纳米脂质体过滤除菌分装后备用或添加冻干保护剂后冻干，液体于在2-8℃保存，冻干品于-20℃以下保存；