[发明专利]大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法

权利要求书

1.一种大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法，其特征在于该方法包括以下步骤： 

（1）制备脂质溶液：该脂质溶液是由包含二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）和3-β-[N-（N’,N’-二甲基氨基乙基）]氨甲酰基胆固醇（DC-Chol）的原料溶解到有机溶剂中，搅拌至溶液澄清透明，有机溶剂的用量使阳离子脂质和磷脂恰好完全溶解，得脂质溶液，溶液温度为20~60℃，

上述原料摩尔百分比组成为：二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）5-95%、3-β-[N-（N’,N’-二甲基氨基乙基）]氨甲酰基胆固醇（DC-Chol）95-5%；

（2）采用交叉流技术使脂质溶液与水化溶剂按体积比1：50～3：17混合，混合后得到的粗脂质体通过超声仪超声，初步分散，通过施压将脂质体通过铺有聚碳酸脂膜的挤压器统一粒径；

（3）流出的脂质体混悬液通过超滤器超滤，除去有机溶剂，超滤时连续补充脂质体水化溶剂，得到空白的纳米脂质体，制成的纳米脂质体过滤除菌分装后备用或添加冻干保护剂后冻干，液体于在2-8℃保存，冻干品于-20℃以下保存；

（4）将中期因子反义寡核苷酸（MK-ASODN）按照溶解在水化溶剂中，得MK-ASODN溶液，将步骤（3）得到脂质体溶液和MK-ASODN溶液按照电荷比1：1～5：1混合或是直接将MK-ASODN溶液加入纳米脂质体冻干品混合得到MK-ASODN纳米脂质体，其中MK-ASODN的序列为CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA。

2.根据权利要求1所述的大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法，其特征在于所述步骤（2）和步骤（4）中的水化溶剂为磷酸盐缓冲液、水、Tris缓冲液或枸橼酸缓冲液。

3.根据权利要求1所述的大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法，其特征在于所述步骤（4）中MK-ASODN纳米脂质体pH为4.0-9.0，所获得的纳米脂质体带正电荷。

4.根据权利要求1所述的大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法，其特征在于所述步骤（1）中的有机溶剂为甲醇、乙醇、叔丁醇中的单一溶剂，或其中的两种或两种以上溶剂制成的混合溶剂。

5.根据权利要求1所述的大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法，其特征在于所述步骤（2）中使用的聚碳酸脂膜的孔径为50~400nm，层数1~10层。

6. 根据权利要求5所述的大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法，其特征在于所述步骤（4）得到的脂质体以液态保存或制为冻干品，冻干保护剂为乳糖、海藻糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇，冻干保护剂浓度在5%-25%（g/ml）。

7. 根据权利要求6所述的大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法，其特征在于步骤（3）所述超声仪为水浴超声法或者探头超声。

8.根据权利要求7所述的大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法，其特征在于步骤（3）脂质溶液与水化溶剂按体积比1：49混合。

9. 根据权利要求8所述的大规模制备注射用中期因子反义寡核苷酸纳米脂质体的方法，其特征在于步骤（4）是将中期因子反义寡核苷酸（MK-ASODN）按照溶解在水化溶剂中，得MK-ASODN溶液，将步骤（3）得到脂质体溶液和MK-ASODN溶液按照电荷比1：1混合。