[发明专利]一种中药注射液致敏性的检测评价方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体设计一种广泛适用于中药注射液致敏性、刺激性的检测评价方法。

背景技术

中药注射液是中药现代化发展中开发出来的一种现代中药制剂，临床使用疗效显著，广泛用于呼吸、心脑血管等领域，并取得了良好的市场经济效益。但是中药注射液在临床使用时经常有不良反应发生，具有安全隐患。临床经常使用的中药注射液品种，如双黄连、清开灵、板蓝根、鱼腥草、穿琥宁、脉络宁、葛根素、复方丹参等品种，均有不良反应报道。

不良反应类型多样，最常发生的是药物性过敏。例如，双黄连注射液中金银花含有绿原酸、清开灵中的角类成分容易造成过敏。溶血反应也常见于中药注射液不良反应，例如鱼腥草注射液中吐温-80超标容易引起溶血。此外，还涉及神经系统、消化系统、心血管系统、感觉器官、泌尿系统、皮肤及其附件等多个系统的不良反应。严重限制了该类品种的用药安全和新药开发。

对于中药注射液中致敏性物质，有效的检验和检测方法对于控制其不良反应至关重要，但是当前尚缺乏高效灵敏的化学检测方法。因此，很有必要在现有技术的基础之上研究开发出一种可靠有效的中药注射液致敏性、刺激性的检测评价方法。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术不能有效检测中药注射液中致敏性的不足，提供一种适用范围广泛，高效、稳定，操作方便、快捷，结果准确的中药注射液致敏性、刺激性的检测方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

(1)使用截留分子质量为1KD至3KD超滤膜富集中药注射液中具有刺激性的大分子部位，备用；

(2)将步骤(1)制备得到的刺激性的大分子部位加入到脏器或外周血液来源的单个核细胞(PBMC)中，共培养1至3天；

(3)取步骤(2)培养后的单个核细胞采用台盼蓝染液染色或荧光染料染色，计数细胞的数目或功能状态来检测和评价中药注射液的致敏性。

作为优选方案，以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法，步骤(1)中药注射液富集的倍数为1至10000倍，作为更优选的技术方案，本发明中药注射液富集的倍数为20至60倍。

作为优选方案，以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法，步骤(2)刺激性的大分子部位加入到脏器或外周血液来源的单个核细胞(PBMC)中培养2至3天。本发明通过大量实验筛选刺激性的大分子部位在单个核细胞(PBMC)中培养时间，实验结果表明，当培养48至72小时小时，能够使单个核细胞在刺激性的致敏原下，细胞增殖达最高。

作为优选方案，以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法，其中所述的单个核细胞PBMC细胞可以是人源或其它实验动物来源，可来自外周血液或脏器的免疫细胞。

作为优选方案，以上所述的超滤膜可以使用工业超滤膜，也可使用商业的超滤离心管，中药制剂在生产和存放过程中可能产生微量的致敏物质，研究需要高浓度的致敏物质。而超滤是一种有效排除小分子干扰的技术，而且3KD的超滤管可截留并富集到高浓度致敏物，具有损耗小、效率高、操作便捷的优点。

中药注射液制剂致敏性的检测方法是一个关键性的问题，本发明提供的中药注射液致敏性的检测评价方法，创造性的采用单个核细胞PBMC激活为模型，PBMC细胞含有抗原递呈细胞，可识别并加工致敏原及类过敏原(如鞣质)与血清蛋白结合成全抗原的抗原信息，并递呈给PBMC中的T、B淋巴细胞。最后通过细胞数量或活力测定来评价注射液致敏物的刺激性，具有操作可靠性强，实验稳定性好等优点。

本发明提供的中药注射液致敏性的检测评价方法，由于富集的大分子部位有较深的颜色，采用MTT法检测细胞活性有明显干扰，误差较大，实验结果不准确。本发明通过大量实验筛选，采用台盼蓝和荧光染色测定PBMC细胞活力；作为优选方案，荧光探针可以是Hochest、PI等多种荧光探针，优化的检测方法是用荧光显微镜或荧光酶标仪检测，具有检测灵敏，高效的优点。

有益效果：本发明提供的中药注射液致敏性的检测评价方法和现有技术相比，具有以下优点：