[发明专利]能抑制口蹄疫病毒的shRNA转基因重组质粒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种应用RNAi技术设计的抗口蹄疫病毒质粒载体，并用于哺乳动物转基因抗病育种。

背景技术

家畜口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物。世界动物卫生组织（OIE）将口蹄疫列为A类传染病之首。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。根据免疫原性，口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）有A、O、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ及AsiaⅠ等共7个血清型。口蹄疫病毒各型之间无交叉免疫反应，一种类型的疫苗不能保护家畜免受另一种类型病毒的感染，已经发现在许多地区会有一个以上病毒流行。如果用一个型的疫苗免疫家畜，有很大的盲目性。为了克服这种免疫的局限性，研究具有广谱抗口蹄疫病毒作用的制剂有重要的实践意义。另外，由于FMDV的具有快速传染性和强致病性的特点，给使用传统的疫苗快速控制口蹄疫的流行带来了障碍。

RNAi技术是科学研究领域近年来取得的重大成就之一，它最大的优点在于具有高度的有效性和特异性并且具有快速的防御与治疗效果。它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显现出不可估量的价值，例如在抗艾滋病毒(HIV),丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰白质炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都发现，RNA干扰对于抑制这些病毒的复制具有较好的效果，可能为这类病毒病的治疗创立新的、更有效的途径。但是在自然界中，各种病毒都会存在不同突变株，口蹄疫病毒就有七种血清型和很多的变异株，这给口蹄疫病毒病的防治工作带来了巨大的困难。另一方面，RNAi有效作用时间较短的特点也给其使用带来一定的问题。在目前已有的科研报道中，RNAi必须在实际病毒感染前1-2天内接种动物才能获得较为理想的抗病毒效果。此外，siRNA/shRNA能否到达口蹄疫病毒在动物体内感染与复制的部位就成为RNAi是否能够高效的干扰靶基因进而抑制病毒的重要问题。

所以本发明选取了FMDV基因组中高度保守的区段作为靶序列，构建能同时表达两种shRNA的转基因质粒载体。再用转基因技术将上述质粒转入细胞或小鼠，使可传代细胞和转基因传代动物产生抗FMDV感染能力。本发明为RNAi技术用于猪、牛、羊等家畜的抗病育种，培养转基因的抗口蹄疫病毒感染的家畜提供新的技术路线。

发明内容

本发明目的是提供一种能高效的抗口蹄疫病毒重组质粒，该重组质粒能通过不同的方法抑制同一型中不同毒株或者不同型的口蹄疫病毒在动物细胞和个体中的复制与感染。本发明的另一目的是提供该抗口蹄疫病毒重组质粒在转基因育种中的应用。

本发明提出的抗口蹄疫病毒重组质粒，记为PB-EN3D2B，该质粒含有两个shRNA表达基因，能同时编码两种分别靶向口蹄疫病毒基因组3D RNA聚合酶和2B非结构蛋白保守区域的特异shRNA；其中，所述两个shRNA表达基因中一个能表达抗口蹄疫病毒的shRNA，该shRNA靶向口蹄疫病毒基因组中3D基因；所述两个shRNA表达基因中一个能表达抗口蹄疫病毒的shRNA，该shRNA靶向口蹄疫病毒基因组中2B基因；两个shRNA表达基因呈串联状态。

本发明提供的的抗口蹄疫病毒重组质粒，其中，在两个shRNA表达基因之间还可插入如报告基因之类的其他基因，得到具有同样抗口蹄疫病毒功能的衍生重组质粒。

本发明中，所选择的保守区基因3D和2B来自任何一型的口蹄疫病毒，如O型、A型、亚洲I型等。

本发明提供的PB-EN3D2B，其表达的shRNA序列是以各个血清型、各个亚型、不同毒株的基因组序列为基准，选取FMDV中特异的3D和2B基因为干扰靶点设计得到的。将该重组质粒通过PB转座子或者直接转染的办法整合入组织培养细胞或动物的基因组，获得单克隆转基因细胞系或者转基因动物家系。特定的转基因细胞系或转基因动物家系可以有效地抵抗不同型FMDV的复制与感染，如抵抗O型、A型、亚洲I型等复制与感染 。