[发明专利]青蟹双顺反子病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种青蟹双顺反子病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒。

背景技术

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)（原被鉴定为锯缘青蟹（Scylla serrata））因肉质鲜美、生长迅速、分布广泛，是我国海洋渔业重要的养殖品种。但随着养殖规模的逐步扩大，病害问题也不断严重。青蟹双顺反子病毒（Mud Crab Dicistrovirus，MCDV）是在近几年的染病青蟹中新发现的一种病原体。感染MCDV的拟穴青蟹体色没有明显变化，食欲不振，活动乏力，即使白天也不会潜入沙中，可导致很高的死亡率。该病毒属于单正链RNA，双顺反子病毒科。由于发现较晚，相关研究很少。MCDV能通过浸泡、禁食浸泡、投喂、共居的方式感染拟穴青蟹。到目前为止，对于MCDV感染还没有有效的治疗方法，杜绝传染源、防止病毒的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断双顺反子病毒是减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法对于疾病的预防具有重要意义。

环介导等温扩增技术（1oop-mediated isothermal amplification，简称LAMP技术），是一种体外扩增特异DNA片段的技术，具有快速、敏感、特异性强等特点，主要是利用4种不同的特异性引物（引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP）识别靶基因的6个特定区段，在聚合酶和等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，扩增反应结束后，可通过目测、染色剂及电泳多种方法对反应产物进行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都选用具有链置换特性的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶。对LAMP来说，4种特异性引物的设计是其关键所在。

LAMP因其自身的优点，现已被广泛用于病原微生物，包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等病传染性疾病的检测和诊断中，但尚未见有将LAMP用于拟穴青蟹双顺反子病毒检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种对青蟹双顺反子病毒具有高特异性，可用于环介导等温扩增技术检测青蟹双顺反子病毒的引物组。

本发明的目的还在于提供一种用上述引物组对青蟹双顺反子病毒进行快速、高效、高特异性检测的方法。

本发明的最后一个目的在于提供含有上述引物组的快速诊断试剂盒。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种青蟹双顺反子病毒检测用引物组，该引物组由如下四条引物组成：

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明的青蟹双顺反子病毒检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的青蟹双顺反子病毒基因组序列，选取青蟹双顺反子病毒基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别青蟹双顺反子病毒的特异性引物组，其能通过PCR来鉴定青蟹双顺反子病毒基因。

引物设计是LAMP技术的关键所在，对于引物设计有许多的要求，如各个引物之间的距离、T_m值以及引物末端稳定性等，因此从200~300个碱基的靶序列中设计四条符合要求的引物存在很大的难度，而本发明根据靶基因序列设计了一种青蟹双顺反子病毒检测用引物组，能特异性识别靶序列上的六个独立区域，在Bst DNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，由于LAMP技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大改善了青蟹双顺反子病毒检测的特异性。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：一种青蟹双顺反子病毒的检测方法，该方法是利用上述的引物组通过LAMP反应和反应后的显色反应，对待测样品中是否含有青蟹双顺反子病毒进行检测。

本发明中的青蟹双顺反子病毒的检测方法，具体含以下步骤：

(1)提取待测样品核酸后反转录的cDNA；

(2)向反应容器中加入上述青蟹双顺反子病毒检测用引物组、LAMP反应液和Bst DNA聚合酶，恒温反应；

(3)反应结束后，向反应管中加入显色液，混匀，通过观察颜色判断待测样品中是否含有青蟹双顺反子病毒。